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水稻组蛋白甲基转移酶和去乙酰化酶基因的功能研究

作　者: 秦付军
导　师: 周道绣
学　校: 华中农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 水稻组蛋白修饰组蛋白甲基化酶组蛋白去乙酰化酶反转座子 DNA甲基化染色质免疫沉淀
分类号: S511
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

组蛋白修饰是表观遗传调控的重要机制之一,包括组蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等其它组蛋白修饰,在动植物生长发育和基因表达调控中发挥着重要的作用。水稻是世界上重要的粮食作物,也是单子叶植物中的模式生物,有关水稻表观遗传调控机制的研究还很少报道,因此研究水稻中组蛋白修饰基因的功能具有重要的意义。本研究主要以水稻的组蛋白甲基转移酶基因(Histone methyltransferase, HMTs)和组蛋白去乙酰化酶基因(Histone deacetylase, HDACs)为研究对象,通过生物信息学、克隆和转化等方法研究了HMTs和HDACs基因的结构、表达和功能,阐述了其在水稻表观遗传调控机制中的作用,主要获得以下结果：1.通过同源序列研究发现,水稻中存在12个组蛋白甲基转移酶SUVH(Suppressor of variegation 3-9 homologue)家族基因和18个HDACs基因；对水稻组蛋白甲基转移酶中SUVH家族和HDAC家族基因进行了系统进化分析,并确定拟研究基因；基因结构分析发现,SUVH家族基因都由YDG-SRA、Pre-SET、SET三个保守的结构域组成；对SUVH和HDAC家族基因进行了水稻全生育期芯片的表达模式分析和愈伤、根、小苗、茎、叶、旗叶和幼穗等特异组织的表达谱分析,发现不同的SUVH家族基因具有相似的表达模式,但表达水平不同。2.对SUVH和HDAC家族中拟研究基因SDG703、SDG704、SDG709、SDG710、SDG713、SDG714、SDG715、SDG726、SDG727、SDG728、HDT701、HDA704、HDA706进行了RNAi干涉载体构建,对基因SDG703、SDG704、SDG709、SDG713、SDG714、SDG715、SDG726、SDG728、HDA706、HDT702、HDA711构建了超量表达载体,并获得独立的转基因植株。3.RNA水平检测SUVH和HDAC结果显示,在超量表达和RNAi植株中,各基因的表达量都有不同程度的上升和下降。4.转基因SUVH成员SDG713和SDG728的下调表达分别引起了植株矮小致死和种子粒厚减小的表型；HDAC成员中HDA704的下调表达引起植株矮化和旗叶基部卷曲,外施赤霉素GA3不能互补HDA704的表型。5.亚细胞定位显示SUVH家族SDG713位于细胞核内,与启动子融合的GFP在根尖、幼茎、雌蕊等组织中特异表达。6.SUVH成员SDG714下调表达引起柱头数目增多等花的变态发育,同时引起miRNA159的上升表达和miRNA164的下降表达。7.SUVH成员转基因材料的Western杂交结果显示,与野生型相比,SDG728在超量表达和：RNAi植株中分别引起H3K9me3修饰的上升和下降；SDG704、SDG726、SDG727在RNAi植株中H3K9me3修饰呈下降变化。8.原核表达GST-SDG728和GST-SDG714组蛋白甲基化酶并进行活性实验,结果显示GST-SDG714可以使小牛核心组蛋白和原核表达重组寡聚组蛋白单甲基化和二甲基化；而GST-SDG728仅能使小牛核心组蛋白甲基化,而不能使原核表达重组寡聚组蛋白甲基化,表明SDG728具有三甲基化活性。9.McrBC-PCR方法检测DNA甲基化结果显示,SDG728调控Tos17和一个Tyl-copia类反转座子Os08g03880的DNA甲基化。另外,SDG703、SDG713、SDG715等也影响上述两个反转座子的甲基化水平。10.染色质免疫沉淀结果显示,SDG728调控Tos17和Os08g03880基因区域的H3K9me3水平,在SDG728超量表达植株中,H3K9me3明显增加；在RNAi植株中,H3K9me3则呈显著下降。上述一系列的结果表明,水稻SUVH成员SDG728是一个组蛋白三甲基化酶,通过调控反转座子基因区域的组蛋白三甲基化水平来影响DNA甲基化水平,进而调控反转座子的表达,维持水稻的基因组稳定,揭示了表观遗传调控在调节转座元件基因表达过程中的分子机制。其它SUVH成员和HDAC成员的研究结果表明其在水稻组蛋白修饰和生长发育中起着重要的作用。

全文目录

缩略词表  7-8
摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
1. 文献综述  12-38
  1.1 表观遗传学概述  12-16
    1.1.1 表观遗传学概念的发展  12-14
    1.1.2 经典遗传学与表观遗传学  14-16
  1.2 染色质是真核生物表观遗传调控的物质基础  16-19
    1.2.1 核小体是染色质的基本单位  16-18
    1.2.2 常染色质与异染色质  18-19
  1.3 表观遗传调控的分子机制  19-33
    1.3.1 DNA甲基化与去甲基化  19-22
    1.3.2 组蛋白修饰  22-31
    1.3.3 染色质重塑(Chromatin remodelling)  31
    1.3.4 其它调控机制  31-33
  1.4 组蛋白HMTs和HDACs在植物基因表达调控和发育中的作用  33-36
    1.4.1 组蛋白甲基化与植物基因调控和发育  33-34
    1.4.2 组蛋白乙酰化/去乙酰化与植物基因调控和发育  34-36
  1.5 研究表观遗传的几种技术和方法  36-37
    1.5.1 染色质免疫沉淀  36
    1.5.2 DNA甲基化分析  36-37
  1.6 本研究的目的和意义  37-38
2. 材料与方法  38-50
  2.1 水稻材料  38
  2.2 水稻组蛋白甲基转移酶基因和去乙酰化酶基因的获取  38-39
    2.2.1 水稻组蛋白甲基转移酶基因和去乙酰化酶基因的整理和归类  38
    2.2.2 序列分析  38
    2.2.3 水稻组蛋白甲基转移酶基因和去乙酰化酶基因的获取  38-39
  2.3 实验所用到的菌株、质粒、载体和感受态细胞  39
  2.4 DNA的抽提和SOUTHERN杂交  39-40
  2.5 RNA的抽提、反转录和NORTHERN杂交  40
  2.6 PCR、RT-PCR和REAL-TIME PCR的检测  40-41
  2.7 组织切片  41
  2.8 遗传转化  41
  2.9 GFP观察  41-42
  2.10 组蛋白抽提和WESTERN印迹  42-43
  2.11 蛋白原核表达与纯化  43-44
  2.12 组蛋白甲基转移酶体外活性测定  44
  2.13 DNA胞嘧啶甲基化分析  44
  2.14 染色质免疫沉淀(CHIP)  44-50
3. 结果与分析  50-91
  3.1 水稻基因组中组蛋白甲基转移酶基因的序列分析与转基因材料的获得  50-58
    3.1.1 水稻组蛋白甲基转移酶SET基因的序列分析  50-56
    3.1.2 遗传转化材料的获得  56-58
  3.2 转基因材料分析与组蛋白甲基转移酶基因功能分析  58-84
    3.2.1 水稻组蛋白甲基转移酶基因结构分析及全长的分析  58
    3.2.2 水稻SUVH基因的表达模式  58-61
    3.2.3 水稻SUVH转基因材料RNA水平表达分析  61-63
    3.2.4 水稻组蛋白甲基转移酶SUVH基因下调表达引起发育表型变化  63-69
    3.2.5 Western Blot检测SUVH转基因植株的组蛋白修饰情况  69-71
    3.2.6 SDG728是一个组蛋白H3K9甲基转移酶  71-76
    3.2.7 SDG728调控DNA甲基化  76-78
    3.2.8 SDG728参与对反转座子的抑制  78-82
    3.2.9 SDG728调控反转座子位点的组蛋白H3K9三甲基化水平  82-84
  3.3 水稻基因组中组蛋白去乙酰化酶基因的序列分析与功能研究  84-91
    3.3.1 水稻组蛋白去乙酰化酶基因的序列获得与分析  84-85
    3.3.2 水稻组蛋白去乙酰化酶基因表达模式分析  85-87
    3.3.3 水稻HDAC转基因材料分析与功能研究  87-91
4. 讨论  91-96
  4.1 OsSUVH基因家族进化  91
  4.2 OsSUVH基因家族的表达谱与功能分析  91-92
  4.3 OsSUVH基因家族与JMJ706之间的关系  92-93
  4.4 SDG728具有H3K9三甲基化功能  93-94
  4.5 SDG728抑制反转座子的表达  94
  4.6 组蛋白HDAC基因在水稻中的功能  94-96
参考文献  96-120
附录Ⅰ 部分实验的操作流程  120-130
作者简介  130-132
致谢  132-133

水稻组蛋白甲基转移酶和去乙酰化酶基因的功能研究

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