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花生四烯酸(arachidonicacid, AA)在生物体内的含量非常丰富,是机体内许多重要的生物活性物质的前体,间接影响着生物体内许多重要的生物学功能。花生四烯酸主要结合于细胞膜内侧脂肪酸上,当受外界生理因素刺激时经磷脂酶A2水解即释放到胞浆中。花生四烯酸经环氧化酶和脂氧化酶途径代谢早已被广泛研究和认识。80年代以来,科学家们发现了花生四烯酸的第三条代谢途径,即花生四烯酸细胞色素P450(CytochromeP450, CYP)代谢途径,它在生物体内的生物学及病理生理学意义逐渐被认识和重视。其中,细胞色素P450表氧化酶代谢花生四烯酸生成四种不同的环氧-二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoic acids,EETs),分别为5,6-EET,8,9-EET,11,12-EET与14,15-EET。CYP表氧化酶主要包括2C和2J两类,其中在人类仅发现了2J2,其在心脏和血管内皮细胞表达最丰富。我们和国外学者已有研究发现EETs在调节心血管系统稳态中发挥着重要作用,包括调节血压、对心脏和血管内皮细胞的保护及抗凋亡作用。心肌肥厚被认为是心力衰竭的发生与发展中的一个重要中间阶段。心肌肥厚是心脏对工作负荷增加的一种代偿性反应,尽管最初的肥厚反应对心脏是有益的,然而持久的心肌肥厚可以导致心力衰竭,而且是主要心血管事件包括缺血性心脏病、心律失常以及猝死的独立危险因素。大量研究表明细胞色素P450表氧化酶-EETs系统在维护心血管系统稳态中具有重要的作用；增加体内EETs的含量具有明显心血管系统的保护作用,同时可能具有抑制心肌肥厚的作用。而细胞色素P450表氧化酶基因在心肌肥厚以及心力衰竭的作用目前尚无报道。在本研究中,我们设想通过使心脏CYP2J2基因表达增加,导致EETs水平增加,在预防和逆转心肌肥厚及心力衰竭的作用中具有重要的保护作用。因此,首先在体外研究外源性EETs和内源性EETs对AngⅡ诱导的心肌细胞肥厚的影响以及可能的分子机制,然后,在AngⅡ诱导的心肌肥厚模型中,研究CYP2J2基因治疗对心肌肥厚的影响以及可能的分子机制,旨在从整体动物水平和细胞水平明确CYP2J2-EETs系统是否能够预防和逆转心肌肥厚,进一步明确CYP2J2-EETs系统是否能够延缓心力衰竭的进展。一、体外实验外源性EETs和内源性EETs抑制心肌细胞肥大的作用及其机制(一)实验方法：1.H9C2细胞培养于含10％FBS的DMEM高糖培养基中,当心肌细胞长至50%左右时,将H9C2细胞同步化处理后分别进行了外源性EETs干预和内源性EETs干预,1)外源性EETs干预：将AngⅡ,EET抑制剂14,15-EEZE, Lorsatan以及14,15-EET一起干预细胞48小时。2)内源性EETs干预：在AngⅡ干预前,用FugeneHD将质粒pcDNA3.1-2J2和pcDNA3.1-GFP分别转染进心肌细胞,同时在pcDNA3.1-2J2组加入CYP2J2选择性抑制剂C26,同样干预48小时。2.将干预的细胞用PBS洗后,用多聚甲醛进行固定,加封闭液封闭半小时,按1：200比例加F-actin染料室温染色1小时后,再用洗脱液进行洗脱,加封片液封片,在荧光显微镜下观察细胞大小,拍照后用软件计算细胞表面积。3.将干预后的细胞用Trizol提取RNA和蛋白质,将RNA逆转录为cDNA后,用Real-time PCR分析β-MHC和ANP的相对量。用Bradford法测量不同干预组的蛋白浓度后,比较各组之间的蛋白含量。4.经过同步化处理的H9C2细胞,将EET, EGFR, PI3K以及PPARy的抑制剂14,15-EEZE, AG1478, LY294002以及GW9662与H9C2细胞以及14,15-EET共同孵育48小时后,收集细胞上清液。将干预后的细胞,用三去污裂解液提取细胞蛋白质,应用Western blot方法检测P-EGFR, EGFR, PI3K, P-AKT, AKT, P-CREB,CREB, ANP的表达。应用ELISA的方法检测细胞上清液中ANP的含量和细胞内cGMP的含量。5.经过同步化处理的H9C2细胞,,随后将AngⅡ和14,15-EET分别干预细胞,并在不同的培养空中添加递增浓度的ANP抗体与AngⅡ和14,15-EET一起干预细胞48小时,随后对心肌细胞进行F-actin染色。6.H9C2细胞经过同步化处理后,加入AngⅡ和14,15-EET分别干预细胞,同时加入ANP受体抑制剂A71915和PKG抑制剂KT5823与14,15-EET共同孵育48小时,随后对心肌细胞进行F-actin染色。收集细胞总蛋白,并分别提取细胞胞浆和胞核蛋白,再用Western blot检测总的CnAβ表达,以及NF-AT的核转位变化。(二)实验结果：1. F-actin染色结果显示,14,15-EET明显抑制了AngⅡ诱导的心肌细胞肥大(P<0.05)；而14,15-EEZE阻断了EET的保护作用(P<0.05)。转染了质粒pcDNA3.1-2J2也显著抑制了心肌细胞肥大,C26完全阻断了CYP2J2的作用(P<0.05)。此外,细胞蛋白含量也证实了EET和CYP2J2的抑制肥厚效应(P<0.05)。EET和CYP2J2没有抑制AngⅡ诱导的ANP的表达增加,反而增加了ANP的表达,但是EET和CYP2J2抑制了心肌肥厚另外一个标记物P-MHC的表达(P<0.05)。2. Western blot检测结果显示,AG1478和LY294002阻断了14,15-EET激活心肌细胞ANP的表达,还发现14,15-EET激活了EGFR、PI3K/AKT、CREB,提示EETs可能通过激活EGFR,PI3K/AKT,CREB信号通路上调ANP的表达(P<0.05)。ELISA检测结果也显示,14,15-EET促进心肌细胞分泌ANP,使胞浆内cGMP的含量增加(P<0.05)。3.在添加了不同浓度的ANP抗体进行干预的实验结果显示,ANP抗体浓度依赖性地阻断了EET的抗心肌细胞肥厚效应(P<0.05)。4.在添加了ANP受体阻断剂和PKG抑制剂干预的实验结果显示,EET的抗心肌细胞肥厚效应被ANP受体阻断剂和PKG抑制剂显著阻断了(P<0.05)。同时,EETs抑制了CnAp表达以及NF-AT的向核内转位,但是其效应被ANP受体阻断剂和PKG抑制剂显著阻断了(P<0.05)。二、体内实验P450表氧化酶基因2J2过表达抑制大鼠心肌肥厚的作用及其机制(一)实验方法：1.实验动物适应性喂养1周后,随机分为6组,每组6只SD大鼠,分别为：对照组注射生理盐水,pcDNA3.1组注射pcDNA3.1, pcDNA3.1-2J2组注射pcDNA3.1-2J2,AngⅡ组注射生理盐水,AngⅡ+pcDNA3.1组注射pcDNA3.1, AngⅡ+ pcDNA3.1-2J2组注射pcDNA3.1-2J2.实验开始前,采用ADI无创血压计记录尾动脉基础血压值。2.真核表达质粒pcDNA3.1与pcDNA3.1-2J2的大量提取和纯化(应用碱裂解法提取,硅藻土纯化法纯化)；目的质粒pcDNA3.1-2J2与对照质粒pcDNA3.1经尾静脉注射导入动物体内,每种质粒注射的剂量是5mg/kg体重,空白对照组注入相同体积的生理盐水。在注射质粒的同时,切开背部皮肤,扩张皮下组织间隙,将含有AngⅡ的压力调控微泵(Alzet 2002)埋入动物皮下,清洁切口后迅速缝合切口。AngⅡ的剂量按照500ng/kg/min的速度释放2周时间。在基因及微泵导入后的第3、7、10、14天,采用ADI无创血压计分别记录尾动脉血压。3.质粒注射及微泵植入2周后,留取24小时尿标本,在戊巴比妥钠麻醉下进行心脏超声检查。处死动物前,动物称重,麻醉后用Millar导管经右颈动脉插入左心室记录心脏血流动力学指标,随后留取血液标本；取心脏,测量大小后拍照记录,并称重计算心脏体重比；心脏,主动脉,肝脏,肾脏等组织放入液氮冷冻后转入-80℃低温冰箱保存备用,部分心脏组织标本放入甲醛溶液中固定,脱水浸腊石蜡包埋后室温保存备用。4.应用ELISA的方法检测动物心脏14,15-DHET和尿cGMP的含量,血清ANP的含量；应用Western blot的方法检测实验动物心脏CYP2J2和ANP的表达,以及P38MAPK、ERK的磷酸化表达,CnAβ的表达、NF-AT的核转位表达情况；对心肌组织切片进行HE染色和天狼星红染色,计算心肌细胞直径大小和胶原沉积情况。(二)实验结果：1.血压测量结果显示,与正常对照组比较,AngⅡ导致了动物血压明显升高,而质粒pcDNA3.1-2J2则明显抑制了AngⅡ诱导的血压升高(P<0.05)。2.注射pcDNA3.1-2J2的大鼠心脏组织的CYP2J2表达显著增加；ELISA检测结果显不,pcDNA3.1-2J2和Ang II+pcDNA-2J2组心脏14,15-EET的含量明显高于对照组(P<0.05)。3.心脏超声检查结果显示,AngⅡ使心脏室间隔和左室后壁明显增厚,pcDNA3.1-2J2抑制了室间隔和左室后壁的增厚(P<0.05)。但是AngⅡ和pcDNA3.1-2J2对射血分数(EF)和短轴缩窄率(FS)均没有明显影响。Millar导管记录的血流动力学结果显示,结果显示AngⅡ使左室舒张末压(LVEDP)明显升高,使左室压力最大下降速度(dp/dt min)显著降低；pcDNA3.1-2J2降低了LVEDP,增加了dp/dt min (P<0.05),但是心率(HR),左室收缩末压(LVESP),心输出量(CO)和左室压力最大上升速率(dp/dt max)均未出现明显改变。4.AngⅡ显著增加了心脏体重比,pcDNA3.1-2J2抑制了心脏体重比的增加(P<0.05)。心脏的H&E染色显示pcDNA3.1-2J2显著抑制了AngⅡ导致心肌细胞肥大(P<0.05),天狼星红染色显示pcDNA3.1-2J2显著改善了AngⅡ导致的心脏胶原沉积(P<0.05)。5. pcDNA3.1-2J2, Ang II, AngⅡ+pcDNA3.1, AngⅡ+pcDNA3.1-2J2组动物的心脏ANP的表达和分泌均是增加的(P<0.05),同时尿cGMP排泄量也是增加的(P<0.05)。6. Western blot检测结果显示,与对照组比较,AngⅡ组与Ang II+pcDNA3.1组心肌组织中P-ERK,CnAβ,核内NF-AT的表达水平显著增加(P<0.05),pcDNA3.1-2J2显著抑制了心肌中P-ERK, CnAp,核内NF-AT的表达水平(P<0.05),而对心肌中P-p38的表达水平无明显影响。结论1.外源性EETs和内源性EETs均能有效地抑制AngⅡ导致的心肌细胞肥大,可能是通过促进ANP的表达和分泌达到抗心肌细胞肥大的作用。2. EETs促进ANP表达和分泌的可能机制是通过激活EGFR/PI3K/AKT/CREB信号通路。3.EETs抑制心肌细胞肥大的可能机制是：EETs激活ANP, ANP与其受体结合后,激活下游的第二信使cGMP,cGMP激活PKG,进而抑制CnAβ的表达以及NF-AT的核内转位。4.在动物体内,CYP2J2基因在心脏的过表达明显抑制了AngⅡ导致的心肌肥厚和心肌重构,其可能机制也是通过上调ANP的表达,抑制CnAβ的表达和NF-AT的核内转位,以及抑制ERK的磷酸化。5. CYP2J2-EETs系统通过上调ANP水平,抑制CnAβ的表达和NF-AT的核内转位,最终抑制心肌肥厚和心肌重构,延缓心力衰竭的进展。本实验的研究结果为将来研究心肌肥厚和心力衰竭的防治新策略,寻找新的药物作用靶点,开发新的治疗药物提供了新的研究方向和理论依据。
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