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缓释肾上腺髓质素支架材料的制备、表征及体外生物活性评价

作　者: 王林
导　师: 周延民
学　校: 吉林大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 壳聚糖 微球 聚丙交酯-乙交酯( PLGA) 纳米羟基磷灰石 肾上腺素质素 人成骨细胞 血管内皮细胞 缓释
分类号: R318.08
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


种植义齿被誉为人类的“第三副牙齿”,他有着传统义齿不可代替的优点,但不是所有病例都是种植义齿修复的适应症,现在存在的最大问题就是骨量不足——局部或大范围的骨缺损。造成骨缺损的原因很多,可以是牙槽嵴的废用性萎缩,也可以是外伤引起的。无论哪种情况都可能使种植体无法很好的存留于牙槽骨内并获得良好的初期稳定性。植骨技术的应用解决了这一难题,但是自体骨源要开辟第二术区,且创伤大患者难以接受,如何得到理想的人工骨支架材料是目前研究的热点。骨支架材料是新生骨组织生长的支架,在骨组织工程中占有重要地位。但是高分子支架材料生物活性较低,力学性能较差,容易引发无菌性炎症;而无机支架材料的生物活性高,力学性能也相对较好,但是如何促进骨细胞迅速的长入支架材料是一个难题。肾上腺髓质素是日本学者从嗜铬细胞瘤中分离出的一种具有广泛生物学效应的肽类物质。他是成骨细胞有效的有丝分裂原,同时又在血管发生中起到关键作用,还参与体内许多其他功能。关于ADM在骨代谢中的研究,国内外尚无定论,有学者认为ADM在体内、体外都对成骨细胞、软骨细胞具有促有丝分裂作用,在体内还具有抑制骨吸收作用,目前尚未发现对破骨细胞有直接影响。同时它是一种新的内皮细胞生长因子,起到促血管生成的作用,是一种有效的血管生成因子。ADM可刺激小鼠后肢缺血模型中肢体血流量的恢复,增加的血流量反映了增加的继发毛细血管密度。因而,在软硬组织的重建中,ADM的促进血管生成特性应发挥了重要作用。将ADM和人工骨支架材料复合后是否会使人工骨支架材料既具有促进骨形成作用又有血管化活性国内外尚无研究。本研究从体外实验的角度探讨了载ADM的PLGA/纳米羟基磷灰石支架材料对成骨样细胞MG63、HUVEC的增殖、分化的影响,Real time PCR探讨支架材料本身及缓释的ADM对成骨及血管化相关基因的影响,Western Blot探讨他们对CollagenⅠ、Runx2、VEGF蛋白表达的影响,为其应用于临床增加骨量提供理论依据。1.不同浓度肾上腺髓质素对MG63、HUVEC增殖及分化的影响目的:采用人成骨样细胞MG63作为成骨细胞模型,HUVEC作为血管内皮细胞模型,评价ADM对其生物学特性的影响。方法:96孔板中成骨样细胞MG63细胞接种于含10%胎牛血清的高糖DMEM中,HUVEC细胞接种于含10%胎牛血清的IMDM中。加入梯度浓度的药物1μL,终浓度为10-13mol·L-1-10-7mol·L-1对照组加入等量的PBS,在加药后1、2、3、4、5天终止。培养通过MTT比色法检测ADM对MG63、HUVEC细胞的增殖活性的影响、通过ALP活性测试检测ADM对MG63细胞的分化活性的影响,找出对两种细胞增殖分化最好的浓度。结果:对于MG63细胞10-9M和10-8M浓度的ADM的促增殖能力最强,而对于HUVEC来说,10-8M ADM促增殖能力最强。我们选择4个高浓度的ADM对MG63的ALP表达进行检测,10-8M、10-7M ADM促成骨细胞分化能力最强。在后续的工作中我们选择10-8 M作为ADM的最优工作浓度。2.载肾上腺髓质素微球复合PLGA/纳米羟基磷灰石支架材料的制备、表征及其降解研究目的:探讨ADM载入壳聚糖微球的可能性,并且制备包裹微球的支架材料,探讨微球与支架材料的表征、机械性能及其体内外降解的能力。方法:以TPP为交联剂采用离子乳化交联法制备壳聚糖微球。并在此过程中将ADM载入其中。应用热致相分离法制备PLGA/nHA支架材料并将载药微球包裹其中。通过扫描电镜表征材料表面性能,动物体内及体外12周的监测材料的降解,通过压缩试验测试材料的机械性能,来判断微球的载入是否给材料本身的性能造成了影响。结果:微球直径均匀,成正态分布,平均直径为42.69μm。利用热致相分离法制备PLGA/nHA支架材料具有典型的多聚物孔状结构,孔径约在50-220μm,且孔与孔之间相互穿通联接。HPLC测定后计算出药物的载药率约为0.058%,包封率79.4%。载药微球前三天突释达到50.7%,从第四天开始缓慢释放,并在第十天达到68.3%。PLGA/nHA/CMs支架材料第1周ADM的释放达到21.0%,2-4周呈线性缓慢释放,第4周末累计释放量达到43.7%,到12周的累计释放量达到51.8%。空白支架材料的孔隙率达到90.8%,而载入30%壳聚糖微球后的孔隙率也可以达到88.9%,两组数据未见明显的统计学差异（P>0.05）。但是空白支架材料的密度（0.045±0.017 ）g/mL却显著的低于载30%微球的支架材料的密度（0.083±0.020）g/mL（P<0.05）。PLGA/nHA/CMs支架材料在前三周代谢稍快,以后达到线性代谢模式,在12周末代谢达到12.23%,而PLGA/nHA空白支架材料到12周末的失重率为8.27%。12周末PLGA/nHA/CMs支架材料组的PBS的PH为6.88±0.12,而PLGA/nHA空白支架材料为6.49±0.09。吸水率方面:PLGA/nHA/CMs支架材料在第一周吸水率即达到66.9%,且逐渐缓慢上升,到第6周达到82.15%后趋于稳定,在12周时达到88.34%。体内降解的失重率:PLGA/nHA/CMs支架材料在前4周代谢较快,第四周末失重率达到10.7%。4-8周趋于平缓,8-12周又处于上升期,到12周时达到21.4%。而PLGA/nHA空白支架材料开始降解较慢,到第8周达到10%,后成直线上升趋势,在12周时达到20.1%。这个数据和12周末PLGA/nHA/CMs空白支架材料的失重率21.4%是基本一致的。压缩试验测试结果显示载入30%微球后材料的抗压强度得到了显著的提升,PLGA/nHA/CMs支架材料的抗压强度为（1.54±0.20）MPa, PLGA/nHA/CMs支架材料抗压模量为（7.24±0.42）MPa。3.载药复合支架材料对MG63、HUVEC增殖及分化的影响目的:采用人成骨样细胞MG63作为成骨细胞模型,HUVEC作为血管内皮细胞模型,评价载药支架材料及空白支架材料对其生物学特性的影响。方法:MG63、HUVEC常规培养,接种于细胞培养板,以PLGA/nHA/CMs/ADM为实验组,PLGA/nHA/CMs为对照组,空细胞为空白对照组。通过材料溶血行为,ALP活性的测定,支架材料表面细胞荧光染色,MTT等检测手段综合评价载药支架材料的溶血性能及生物活性。结果:复合空白微球的支架材料溶血率为0.171%,远远小于5%,接近阴性对照。说明本研究中复合微球的支架材料是安全的,无急性溶血活性。载药支架材料以及支架材料本身对成骨细胞以及血管内皮细胞的增殖以及成骨细胞的分化均有一定的促进作用。4.载ADM复合支架材料对MG63、HUVEC相关功能基因及蛋白的影响目的:采用人成骨样细胞MG63作为成骨细胞模型,HUVEC作为血管内皮细胞模型,探讨载药支架材料对两种细胞内成骨及血管化相关基因和蛋白表达的影响,方法:MG63、HUVEC常规培养,接种于材料表面,以PLGA/nHA/CMs/ADM为实验组,PLGA/nHA/CMs为对照组,空细胞为空白对照组。分别于1、3、5天终止培养,消化细胞,提取RNA和蛋白。用Real time PCR和Western Blot的方法检测COL1α1,Runx2,SP7,OPN,VEGF,RAMP2基因的表达及VEGF、CollagenⅠ、RUNX2蛋白的表达水平。结果:Real-time PCR结果显示实验组MG63细胞内Runx2 mRNA的表达在第1天略高于对照组,显著的高于空白对照组;第3天,实验组、对照组Runx2表达水平均显著上调;第5天三组mRNA水平均有所下调,实验组mRNA水平略高于空白对照组。而第1天实验组SP7 mRNA表达水平略低于对照组,和空白对照组基本处于同一水平,第3天,实验组SP7表达显著上调,高于空白支架组和空白对照组;第5天时实验组的SP7表达更高,是对照组的2.7倍,是空白对照组的4.68倍。且对照组显著的高于空白对照组,是其1.73倍。对照组OPN mRNA表达水平在第1天就显著增高,第3天趋势与第1天相似,第5天三组未见明显的区别。实验组MG63细胞内COL1α1 mRNA的表达在第3天和第5天显著的高于对照组和空白对照组,空白对照组和对照组的COL1α1 mRNA一直处于同一水平。实验组材料表面HUVEC细胞内RAMP2基因的表达在第1天略低于空白对照组但略高于空白支架组。第3天,实验组RAMP2基因的表达量显著增高,是空白支架组的2.3倍,是空白对照组的2.4倍;第5天,载药支架组RAMP2基因的表达量是空白支架组的2.06倍,是空白对照组的2.57倍。而VEGF基因的表达在第1、3、5天均显著的高于对照组和空白对照组,第1天VEGF基因表达量是对照组的1.78倍,是空白对照组的1.68倍。第3天VEGF基因表达量是对照组的1.55倍,是空白对照组的2.1倍。第五天VEGF基因表达量是对照组的1.88倍,是空白对照组的2.32倍。对照组和空白对照组在第1天未见显著差别,第3、5天对照组VEGF基因表达量略低于空白对照组。Western Blot检测第1天实验组Runx2的蛋白表达量显著高于空白对照组和对照组。第3天,实验组Runx2的蛋白表达量显著高于空白对照组,而对照组Runx2的蛋白表达量显著低于空白对照组。第5天,对照组和实验组的Runx2的蛋白表达量无显著性差异,而空白对照组Runx2的蛋白表达量显著低于对照组和实验组。Western Blot显示第1天,实验组和对照组的CollagenⅠ的蛋白表达量显著的高于空白对照组。第3天,实验组CollagenⅠ的蛋白表达量与空白对照组无明显差异,同mRNA水平的变化基本一致。Western Blot检测VEGF的蛋白表达量的结果显示第1天,实验组和对照组VEGF的蛋白表达量显著高于空白对照组。第3天,三组间未见显著性差异,第5天,实验组VEGF蛋白表达量显著高于对照组与空白对照组。综上所述,ADM对成骨细胞、血管内皮细胞有着显著的促增殖和分化作用,制备的ADM-壳聚糖微球载入PLGA/nHA支架材料对成骨细胞、血管内皮细胞也有着促增殖和分化作用,并在早期可以促进成骨及血管化相关基因及蛋白的表达,本研究为缓释ADM的支架材料应用于口腔种植领域提供了理论基础。

全文目录


前言  4-5
中文摘要  5-10
Abstract  10-21
绪论  21-22
第1章 文献综述  22-54
  1.1 肾上腺髓质素的在骨代谢中的研究进展  22-32
    1.1.1 肾上腺髓质素的特点  22-26
    1.1.2 肾上腺髓质素在骨代谢过程中的作用  26-28
    1.1.3 肾上腺髓质素在血管发生过程中的作用  28-32
    1.1.4 小结  32
  1.2 载药壳聚糖微球的研究进展  32-43
    1.2.1 载药壳聚糖微球的制备方法  35-40
    1.2.2 壳聚糖微/纳米颗粒的药物加载  40-41
    1.2.3 壳聚糖微粒系统的药物应用  41-43
    1.2.4 小结  43
  1.3 骨支架材料的现状与进展  43-54
    1.3.1 金属合金材料  44
    1.3.2 生物陶瓷类材料  44-50
    1.3.3 天然高分子聚合物  50-51
    1.3.4 合成高分子聚合物  51-54
第2章 不同浓度肾上腺髓质素对MG63、HUVEC 增殖及分化的影响  54-64
  2.1 材料及方法  54-59
    2.1.1 主要实验仪器及设备  54-55
    2.1.2 主要材料与试剂  55
    2.1.3 梯度浓度肾上腺髓质素的配置  55
    2.1.4 细胞培养  55-57
    2.1.5 MTT 法检测肾上腺髓质素细胞增殖活力  57-58
    2.1.6 比色法测定MG63 内碱性磷酸酶的表达  58
    2.1.7 统计学分析  58-59
  2.2 结果  59-61
    2.2.1 不同浓度ADM 对MG63 细胞增殖活性的影响  59
    2.2.2 不同浓度ADM 对HUVEC 细胞增殖活性的影响  59-60
    2.2.3 不同浓度ADM 对MG63 细胞分化能力的影响  60-61
  2.3 讨论  61-63
  2.4 小结  63-64
第3章 载肾上腺髓质素微球复合PLGA/纳米羟基磷灰石支架材料的制备、表征及其降解研究  64-79
  3.1 材料及方法  64-68
    3.1.1 主要实验仪器及设备  64-65
    3.1.2 主要材料与试剂  65
    3.1.3 壳聚糖微球（CMs）的制备  65
    3.1.4 PLGA/nHA 支架材料的制备  65-66
    3.1.5 微球及支架材料的扫描电镜观察  66
    3.1.6 微球中多肽的载药率和包封率的分析  66
    3.1.7 载药微球及支架材料的体外释放行为  66
    3.1.8 支架材料的孔隙率和密度  66-67
    3.1.9 复合支架材料的体外降解  67
    3.1.10 复合支架材料的体内降解  67-68
    3.1.11 复合支架材料抗压强度  68
    3.1.12 统计学分析  68
  3.2 结果  68-74
    3.2.1 扫描电镜观察TPP-壳聚糖微球及PLGA/nHA 支架材料的表面形貌  68-69
    3.2.2 微球中多肽的载药率和包封率  69-70
    3.2.3 载药微球及支架材料的体外释放  70
    3.2.4 支架材料的孔隙率和密度  70-71
    3.2.5 复合支架材料的体外降解  71-73
    3.2.6 复合支架材料的体内降解失重率  73
    3.2.7 复合支架材料的机械性能  73-74
  3.3 讨论  74-78
    3.3.1 TPP-壳聚糖微球及PLGA/nHA 支架材料的制备及表征  74-76
    3.3.2 复合支架材料的降解  76-78
  3.4 小结  78-79
第4章 载药复合支架材料对MG-63、HUVEC 增殖及分化的影响  79-87
  4.1 材料及方法  79-82
    4.1.1 主要实验仪器及设备  79
    4.1.2 主要材料与试剂  79-80
    4.1.3 复合支架材料的标本制备  80
    4.1.4 复合空白微球的支架材料的体外溶血实验  80-81
    4.1.5 复合支架材料对成骨细胞及血管内皮细胞的增殖的影响  81
    4.1.6 MG63、HUVEC 细胞在支架材料上的生长状况  81
    4.1.7 复合支架材料对成骨细胞分化能力的影响  81
    4.1.8 数据分析  81-82
  4.2 结果  82-84
    4.2.1 载空白微球支架材料的体外溶血行为  82
    4.2.2 复合支架材料对成骨细胞及血管内皮细胞的增殖的影响  82-83
    4.2.3 MG63、HUVEC 细胞在支架材料上的生长状况  83
    4.2.4 复合支架材料对成骨细胞分化的影响  83-84
  4.3 讨论  84-86
  4.4 小结  86-87
第5章 载ADM 复合支架材料对MG63、HUVEC 相关功能基因及蛋白的影响  87-107
  5.1 材料及方法  87-95
    5.1.1 主要实验仪器及设备  87-88
    5.1.2 主要材料与试剂  88
    5.1.3 主要试剂的配方及配置方法  88-89
    5.1.4 载药复合支架材料表面MG-63、HUVEC 细胞相关基因表达.  89-93
    5.1.5 载药复合支架材料表面MG-63、HUVEC 细胞相关蛋白的表达  93-94
    5.1.6 数据分析  94-95
  5.2 结果  95-101
    5.2.1 Real time PCR 检测MG-63、HUVEC 细胞相关基因表达量  95-99
    5.2.2 Western Blot 检测MG-63、HUVEC 细胞相关蛋白表达量  99-101
  5.3 讨论  101-106
  5.4 小结  106-107
第6章 结论  107-108
参考文献  108-124
作者简介及在学期间所取得的科研成果  124-126
致谢  126-127

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医用一般科学 > 生物医学工程 > 一般性问题 > 生物材料学
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