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茯苓辐照降解及其产物生物活性研究

作　者: 龚志华
导　师: 施兆鹏
学　校: 湖南农业大学
专　业: 茶学
关键词: 茯苓多糖辐照降解生物活性糖脂代谢高通量筛选安全性评价
分类号: S567.32
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

茯苓是一种资源丰富、多糖含量高、成分较为单一的典型多糖菌类植物,其多糖具有抗病毒、抗肿瘤、抗炎症、增强免疫和防石利尿等多种生理功能。目前国内外对茯苓的研究与开发主要集中于传统中药制剂开发和茯苓糖类物质的化学组成、分子修饰、生物活性以及提取制备技术等研究方面。研究表明,茯苓主体多糖成分β-茯苓聚糖是一类含有少量β-(1→6)葡聚糖支链的β-(1→3)-D-葡聚糖,分子结构结合紧密,水溶性较差,生物活性较低。采用新型多糖降解技术,将茯苓多糖转化为分子量较小且生物利用率较高的活性多糖是茯苓及其多糖高效开发利用的关键。本研究集成辐照降解、现代光谱、柱色谱分离纯化以及用于功能与安全性评价的高通量筛选、细胞培养、动物实验等先进技术,对茯苓辐照降解产物、茯苓水溶性多糖高效制备、辐照降解产物抗氧化与调节糖脂代谢的生物活性及安全性等内容进行了系统研究,获得了以下结果：1、首次采用60Co辐照降解茯苓多糖,并运用扫描电镜、水溶性糖分析、紫外光谱扫描、红外光谱扫描、凝胶渗透色谱、DEAE-52纤维素柱层析等先进技术方法,’系统研究了辐照处理对茯苓多糖降解的微观效应。结果表明,茯苓分别经600 kGy、800 kGy、1000 kGy、1200 kGy剂量辐照后,水溶性总糖、水溶性多糖含量显著增加,并呈剂量效应,其中1000kGy处理分别增加18倍、19倍以上,降解产物主要为含有羰基基团的分子量较小的酸性多糖,其数均相对分子量在10128-11881之间、重均相对分子质量在23995-27917之间,且基本组成与茯苓原料多糖的基本组成类似。2、系统比较了热水提取、超声波辅助提取、微波辅助提取三种物理方法以及β-葡聚糖酶、植物复合酶SPE-002两种酶法辅助提取茯苓水溶性多糖的效果。结果显示,酶法辅助提取是较好的方法,且采用p-葡聚糖酶较好,其最优参数为酶用量6.5%、提取时间60 min、提取温度50℃、提取体系pH值5.0,茯苓水溶性多糖得率达13.31%。微波辅助提取是三种物理方法中的最优方法,其最优参数为中低火(231 w)、时间60min、固液比1：25,茯苓水溶性多糖得率为3.66%。3、首次应用p-葡聚糖酶辅助降解辐照后茯苓多糖,结果表明,低剂量辐照-酶解具有一定协同作用,各因素影响大小依次为辐照剂量>酶促降解温度>酶促降解时间>酶促降解体系pH值>酶用量,其中辐照剂量因素影响显著。采用辐照剂量1000 kGy,在最优酶解参数条件下,茯苓水溶性多糖得率为43.57%,茯苓1000 kGy辐照后直接提取的水溶性多糖得率为45.15%。由此可以推断p-葡聚糖酶对1000 kGy与1200 kGy辐照剂量处理产生的水溶性茯苓多糖进行了“过度降解”,产生一些分子量更小的物质。为提高水溶性茯苓多糖得率,采用1000 kGy剂量辐照处理即可,而不需采用辐照-酶解协同降解。4、不同辐照剂量处理茯苓水提取物的体外抗氧化功能结果表明,茯苓辐照后,还原能力增强,并对超氧阴离子自由基、羟基自由基、DPPH自由基均具有显著的清除作用,且呈一定剂量效应,以1000 kGy辐照剂量处理的茯苓水提取物的综合抗氧化能力最强。5、首次运用高通量筛选和细胞试验技术研究了辐照降解茯苓多糖产物调节糖脂代谢的功能。结果显示,1000 kGy辐照剂量处理的茯苓水提取物对LXR核受体模型、PPARy核受体模型、FXR激活受体模型、PPARa激活核受体模型均有一定的调节糖脂代谢功能,其中对前三个核受体模型的活性明显,而其80%乙醇醇沉物仅对LXR核受体模型、PPARy核受体模型有一定的生物活性,说明辐照处理可以增强茯苓调节糖脂代谢功能。利用1 mL/L 20%脂肪乳剂处理48 h能够成功复制细胞模型,可应用于非酒精性脂肪肝药物筛选,经过1000 kGy辐照处理的茯苓能够显著降低非酒精性脂肪肝细胞内的TG及ALT水平,并明显优于其它处理。茯苓辐照后,降血糖功能增强,并主要体现在抑制AGEs形成、抑制醛糖还原酶活性和促进葡萄糖消耗与摄取等几方面,其中1000 kGY辐照处理的水溶性多糖可通过促进葡萄糖消耗与摄取而直接降低血糖,也可通过抑制蛋白质非酶糖基化产物的形成来防止高糖诱导的并发症发生。6、高通量筛选、细胞毒性试验和动物安全性评价结果证实,经辐照处理的茯苓水提取物与水溶性多糖提取物安全无毒。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-14
第一章绪论  14-27
  1 茯苓糖类物质研究进展  14-20
    1.1 茯苓资源研究概况  14-15
    1.2 茯苓糖类物质化学研究进展  15-16
    1.3 茯苓糖类物质生物活性研究进展  16-17
    1.4 茯苓多糖提制技术研究进展  17-20
      1.4.1 茯苓多糖提取技术研究进展  17-19
      1.4.2 茯苓多糖分离纯化技术研究进展  19-20
    1.5 茯苓多糖研究开发趋势  20
  2 辐照降解植物多糖类物质研究进展  20-24
    2.1 辐照原理、优点及安全性  20-21
    2.2 辐照降解机制及影响因素  21-22
    2.3 辐照技术在降解植物多糖类物质中的应用  22-24
  3 研究目的与意义  24-25
  4 主要研究内容及技术路线  25-27
    4.1 主要研究内容  25-26
    4.2 技术路线  26-27
第二章茯苓辐照降解理化效应研究  27-47
  第一节茯苓辐照降解微观效应研究  27-37
    1 材料与方法  27-30
      1.1 材料、试剂与仪器设备  27-28
      1.2 实验方法  28-30
    2 结果与分析  30-35
      2.1 茯苓辐照处理的微观结构分析  30-32
      2.2 茯苓辐照处理的水溶性糖含量分析  32-33
      2.3 茯苓辐照处理水溶液pH值分析  33
      2.4 茯苓辐照处理的紫外光谱分析  33-35
      2.5 茯苓辐照处理的红外吸收光谱分析  35
    3 讨论  35-37
  第二节茯苓辐照降解产物相对分子量与组成分析  37-46
    1 材料与方法  38-41
      1.1 材料、试剂与仪器设备  38-39
      1.2 实验方法  39-41
    2 结果与分析  41-45
      2.1 茯苓辐照降解产物的相对分子量分析  41-44
      2.2 茯苓辐照降解产物的多糖组成分析  44-45
    3 讨论  45-46
  本章小结  46-47
第三章辐照-酶法协同降解茯苓多糖研究  47-77
  第一节茯苓水溶性多糖的不同提取方法比较研究  47-57
    1 材料与方法  47-49
      1.1 材料、试剂与仪器设备  47
      1.2 试剂与仪器  47-48
      1.3 实验方法  48-49
      1.4 检测方法  49
      1.5 计算方法  49
      1.6 统计分析方法  49
    2 结果与分析  49-56
      2.1 茯苓水溶性多糖不同提取方法的单因素实验结果与分析  49-52
      2.2 茯苓水溶性多糖不同提取方法的正交实验结果与分析  52-56
    3 讨论  56-57
  第二节不同生物酶制剂辅助提取茯苓水溶性多糖研究  57-68
    1 材料与方法  57-59
      1.1 材料、试剂与仪器设备  57-58
      1.2 实验方法  58-59
      1.3 检测方法  59
    2 结果与分析  59-66
      2.1 β-葡聚糖酶辅助提取茯苓水溶性多糖技术参数优化  59-63
      2.2 植物复合酶SPE-002辅助提取茯苓水溶性多糖技术参数优化  63-66
      2.3 β-葡聚糖酶、植物复合酶SPE-002辅助提取茯苓水溶性多糖的验证实验结果与分析  66
    3 讨论  66-68
  第三节酶法辅助降解辐照后茯苓多糖研究  68-75
    1 材料与方法  68-70
      1.1 材料、试剂与仪器设备  68-69
      1.2 实验方法  69-70
      1.3 检测方法  70
    2 结果与分析  70-74
      2.1 β-葡聚糖酶辅助降解辐照后茯苓多糖的单因素实验结果与分析  70-72
      2.2 β-葡聚糖酶辅助降解辐照后茯苓多糖的正交实验结果与分析  72-74
      2.3 β-葡聚糖酶辅助降解辐照后茯苓多糖的验证实验结果与分析  74
    3 讨论  74-75
  本章小结  75-77
第四章茯苓辐照降解产物生物活性研究  77-110
  第一节茯苓辐照处理水提取物的体外抗氧化功能研究  77-84
    1 材料与方法  78-80
      1.1 材料、试剂与仪器设备  78-79
      1.2 实验方法  79-80
    2 结果与分析  80-83
      2.1 茯苓辐照处理水提取物的还原力分析  80-81
      2.2 茯苓辐照处理水提取物清除超氧阴离子自由基作用分析  81-82
      2.3 茯苓辐照处理水提取物清除羟基自由基作用分析  82
      2.4 茯苓辐照处理水提取物清除DPPH自由基作用分析  82-83
    3 讨论  83-84
  第二节茯苓辐照降解产物调节糖脂功能的高通量筛选研究  84-90
    1 材料与方法  85-87
      1.1 材料、试剂与仪器设备  85
      1.2 实验方法  85-87
    2 结果与分析  87-89
      2.1 样品对模型细胞SMMC-7721的毒性测试  87
      2.2 样品调节糖脂功能的核受体模型表征结果与分析  87-89
    3 讨论  89-90
  第三节茯苓辐照降解产物调节血脂功能的细胞实验  90-99
    1 材料与方法  90-93
      1.1 材料、试剂与仪器设备  90-91
      1.2 实验方法  91-93
      1.3 统计学分析  93
    2 结果与分析  93-97
      2.1 非酒精性脂肪肝细胞模型的建立  93-95
      2.2 茯苓提取物样品添加浓度选择  95-96
      2.3 茯苓提取物样品对非酒精性脂肪变性肝细胞的干预作用  96-97
    3 讨论  97-99
      3.1 非酒精性脂肪肝细胞模型的建立  97-98
      3.2 茯苓辐照处理提取物对脂肪变性肝细胞内的TG影响  98-99
  第四节茯苓辐照降解产物调节血糖功能的细胞实验  99-108
    1 材料与方法  99-103
      1.1 材料、试剂与仪器设备  99-100
      1.2 实验方法  100-103
      1.3 统计学分析  103
    2 结果与分析  103-107
      2.1 茯苓辐照处理提取物样品的蛋白质非酶糖基化实验结果分析  104
      2.2 茯苓辐照处理提取物样品的葡萄糖苷酶实验结果分析  104
      2.3 茯苓辐照处理提取物样品的醛糖还原酶实验结果分析  104-105
      2.4 茯苓辐照处理提取物样品的葡萄糖消耗实验结果分析  105-107
      2.5 茯苓辐照处理提取物样品的葡萄糖摄取实验结果分析  107
    3 讨论  107-108
  本章小结  108-110
第五章茯苓辐照降解产物安全性评价  110-119
  1 材料与方法  110-112
    1.1 材料、试剂与仪器设备  110
    1.2 实验方法  110-112
    1.3 统计分析方法  112
  2 结果与分析  112-118
    2.1 小鼠急性毒性实验结果  112
    2.2 小鼠骨髓细胞微核实验结果分析  112-113
    2.3 小鼠精子畸形实验结果分析  113
    2.4 SD大鼠30天喂养实验结果  113-118
  本章小结  118-119
全文总结  119-122
  1 主要结论  119-120
  2 主要创新点  120-121
  3 展望  121-122
参考文献  122-135
缩写词  135-136
致谢  136-137
作者简介  137

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