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蛹拟青霉对三种重要微量元素的有机转化及有机转化物的功能研究
作 者: 陈宏伟
导 师: 樊美珍；李增智
学 校: 安徽农业大学
专 业: 微生物学
关键词: 蛹拟青霉 蛹虫草 硒 锌 锗 功能
分类号: S567.35
类 型: 博士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
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本研究利用蛹虫草无性型——蛹拟青霉(Paecilomyces militaris)为载体,采用液体深层发酵法对硒、锌、锗三种重要微量元素进行富集和有机转化,探索了蛹虫草菌丝体对三种微量元素的富集、有机转化情况、蛹虫草菌丝体活性成分变化情况、微量元素与蛹虫草菌丝体代谢物的结合形式、微量元素在菌丝体内的分布以及有机转化物的生物活性和功能等问题,为更好地研制和开发对人体有益,且安全、高效,既能补充微量元素又具有生理活性的功能性食品和医用药物奠定基础。1、以生物量和微量元素硒、锌、锗的富集能力为指标,对本实验室已有的30株蛹拟青霉进行了筛选。实验结果表明,不同菌株对硒、锌、锗的富集能力各不相同,富集能力的高低基本上与菌丝体生物量和硒、锌、锗有机转化率有关。菌丝体的耐硒能力最弱,耐锌能力较好,耐锗能力最强；从有机转化率来看,硒最高,锌次之,锗最低。(1)富硒能力最强的菌株为PM14号菌株,在Na2Se03浓度为20μg/mL条件下,有机硒转化率达到31.6%。其生物量在相同浓度下也最高,达到17.0 mg/mL。(2)富锌能力较好的菌株为PM28号和PM14号菌株,在ZnS04浓度为200μg/mL条件下,有机锌转化率分别达到6.65%和5.78%。在相同浓度下,其生物量达到最大分别为19.5 mg/mL,17.6 mg/mL(3)富锗最佳菌株为PM28号菌株和PM14号菌株,在锗浓度为500μg/mL条件,有机锗转化率分别达到2.3%和1.9%。在相同浓度下,其生物量分别为15.1 mg/mL，13.8 mg/mL。从总体上衡量,由于PM14号菌株富集硒、锌、锗的能力都很强,因此,确定PM14号菌株为进一步研究的菌株。2、研究了有机硒、锌、锗在蛹拟青霉菌丝体内蛋白质、多糖和核酸等大分子物质中的含量分布情况。实验结果表明,有机硒、锌、锗含量在蛋白质中最多,其次是多糖,最少的是核酸。硒、锌、锗浓度对其含量有影响,当浓度过高或过低时其含量均降低。(1)当培养基中Na2Se03浓度为20μg/mL时,蛋白质、多糖、核酸中有机硒含量均达到最多,分别为221.5μg/g、86.2μg/g和0.6μg/g;当Na2Se03浓度为10μg/mL时,蛋白硒、多糖硒和核酸硒分别占菌丝体总有机硒的比例最大,分别为菌丝体总有机硒的65.8%、28.1%和0.2%,分别是空白的2.7倍、3.9倍和3.8倍。蛋白、多糖、核酸中总的有机硒含量在培养基Na2Se03浓度为20μg/mL时最多为308.4μg/g。在培养基Na2Se03浓度为10μg/mL时,蛋白硒、多糖硒、核酸硒在菌丝体总有机硒中占的比例最大,达到94.1%。(2)在实验锌浓度范围内,随着培养基中锌浓度的增加,蛋白质、多糖、核酸中有机锌的含量不断增加,蛋白质、多糖中有机锌占菌丝体总有机锌的比例都随着培养基中锌浓度的增加而增加,而核酸中有机锌比例却不断减少,但变化不明显。当ZnSO4浓度为200μg/mL时,有机锌含量最多,其在体内的分布情况是,蛋白质最多占菌丝体总有机锌的65.6%,其次是多糖有机锌占7.2%,核酸中有机锌最少,只占0.8%。此时蛋白锌和多糖锌分别是空白的2.2倍和1.1倍,而核酸锌却比空白少了33.9%。由此可见锌对蛋白质和多糖中有机锌合成的促进作用比较明显。(3)实验表明,低浓度锗对蛋白质、多糖、核酸中有机锗的含量有促进作用,高浓度锗对有机锗的形成有一定的抑制作用。当Ge02浓度为500μg/mL时,蛋白质、多糖、核酸中有机锗含量均达到最大,分别达到284.0μg/g、261.5μg/g和137.6μg/g,分别是空白组的4.4倍、5.4倍和8.3倍。蛋白锗和多糖锗所占菌丝体总有机锗比例相似。当Ge02浓度在100μg/mL时,蛋白质、多糖和核酸中的有机锗含量占菌丝体总有机锗的比例最高,分别达到39.8%,36.8%和18.2%。蛋白、多糖和核酸中有机锗之和在Ge02浓度为100μg/mL时,所占菌丝体总有机锗比例最大,达到94.8%。3、探讨了硒、锌、锗浓度对蛹拟青霉菌丝体的生物量和主要活性成分(胞内多糖、微量元素含量、虫草素、菌丝体SOD、蛋白质含量、氨基酸含量等)的影响。结果表明,硒、锌、锗在适宜浓度范围内,对菌丝体的主要活性成分有促进作用,浓度过大,对相关活性成分有抑制作用,不同的生物学指标所需的硒、锌、锗浓度各不相同。硒、锌、锗的适宜浓度分别为：10-20μg/mL,100μg/mL和200μg/mL-300μg/mL。4、抗氧化作用实验表明,富硒、锌、锗多糖均具有较好的清除超氧自由基、羟自由基和有机自由基DPPH的能力,硒、锌多糖清除自由基的能力与空白多糖相比具有显著差异。从清除自由基的种类来看,它们清除DPPH的能力最强,其次是羟自由基,最后是氧自由基。总体来看,硒多糖清除自由基能力最好,其次是锌多糖,最后是锗多糖。5、果蝇寿命实验表明,硒、锌、锗多糖对果蝇的半数死亡时间、平均寿命和最高寿命都有显著影响,对果蝇具有明显的延缓衰老作用。多糖对半数死亡时间的延长最好,而且是雄性好于雌性；硒多糖对最高寿命和平均寿命的影响无显著差异,锌、锗多糖对之的影响是最高寿命好于平均寿命,从性别差异来看,基本上是雌性优于雄性。硒多糖对于增加体弱果蝇的寿命效果显著,锌、锗多糖对于延长体魄强壮果蝇的寿命较好。6、小鼠负重游泳力竭实验、血乳酸含量和血尿素氮含量测定以及小鼠常压耐缺氧实验结果表明,富硒、锌、锗这三种蛹虫草菌丝体不同浓度对小鼠不同生理时期具有不同的耐疲劳能力。它们可以显著延长小鼠负重游泳力竭实验时间,具有明显减少小鼠在疲劳状态下体内产生乳酸的作用,对疲劳过程中产生的血尿素氮也有显著的减少或清除作用。然而,它们的耐缺氧效果不够明显。7、蚕豆微核实验表明,富硒、锌、锗多糖没有致突变作用,对抑制丝裂霉素和紫外线诱发的蚕豆根尖细胞微核的产生具有显著作用,多糖浓度与微核抑制率有明显的剂量-效应关系,微核抑制率随着多糖浓度的增加而增加。当多糖浓度为100μg/mL时,富硒、锌、锗多糖对丝裂霉素和紫外线诱发微核的抑制率分别为46.5%、37.2%、34.1%和53.3%、48.6%、43.8%。对微核的抑制效果是富硒多糖>富锌多糖>富锗多糖。8、体外抗肿瘤实验表明,硒多糖、锌多糖对肺腺癌A549细胞株生长的抑制作用与空白对照具有极显著差异,可以显著提高对肺腺癌A549细胞株生长的抑制作用,当多糖浓度为4 mg/mL时,硒多糖和锌多糖对肺腺癌A549细胞株生长的抑制率分别为54.2%和53.9%,分别比空白菌丝体多糖的抑制率提高38.8%和38.0%。硒、锌、锗多糖对鼻咽癌CNE-1细胞株生长的抑制作用与空白对照均具有极显著差异,当多糖在浓度为4 mg/mL时,硒、锌、锗多糖对鼻咽癌CNE-1细胞生长的抑制率分别为40.2%,32.1%和39.56%,分别比空白对照提高128.8%、82.4%和125.2%。硒、锌、锗多糖可以显著提高鼻咽癌CNE-1细胞株生长的抑制作用。9、小鼠急性经口毒理实验表明,蛹拟青霉富硒、锌、锗菌丝体属于无毒级产品。本研究表明,蛹拟青霉液体培养菌丝体具有较好的富集硒、锌、锗的能力,在适当的微量元素浓度时,富集微量元素后的菌丝体主要活性成分含量有明显提高,富硒、锌、锗菌丝体及微量元素有机物的抗氧化、抗疲劳、抗突变和抗肿瘤能力有显著增强,小鼠急性经口毒理实验和蚕豆根尖细胞微核实验表明,富硒、锌、锗蛹拟青霉菌丝体没有致突变作用,对小鼠无毒性。
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全文目录
摘要 3-6
Abstract 6-10
目录 10-16
主要缩略词和符号表 16-18
附图清单 18-20
附表清单 20-22
第一章 综述 22-54
1.1 蛹虫草研究概况 22-36
1.2 微量元素研究概况 36-43
1.2.1 硒的生理功能及硒的富集 37-41
1.2.2 锌的生理功能及锌的富集 41-43
1.2.3 锗的生理功能及锗的富集 43
1.3 蛹虫草产品的研究开发概况 43-47
1.4 生物活性物质及功能性评价方法 47-54
1.4.1 生物活性物质 47-48
1.4.2 生物活性物质的功能学评价方法 48-54
1.4.2.1 抗疲劳作用的功能学评价方法 48-49
1.4.2.2 耐缺氧作用的功能学评价方法 49
1.4.2.3 抗突变作用的功能学评价方法 49
1.4.2.4 抗衰老作用的功能学评价方法 49-50
1.4.2.5 抑制肿瘤作用的功能学研究及抗肿瘤药物的筛选方法 50-51
1.4.2.6 生物活性物质的安全性评价 51-54
第二章 引言 54-56
第三章 蛹拟青霉微量元素高富集菌株的筛选 56-74
第一节 蛹拟青霉高富硒菌株的筛选 56-62
1 材料与方法 56-60
1.1 材料 56-58
1.2 方法 58-60
2 结果与分析 60-61
2.1 蛹拟青霉富硒菌株的生物量 60
2.2 蛹拟青霉不同菌株的富硒能力 60-61
3 讨论与结论 61-62
第二节 蛹拟青霉高富锌菌株的筛选 62-67
1 材料与方法 62-65
1.1 材料 62-63
1.2 方法 63-65
2 结果与分析 65-66
2.1 蛹拟青霉富锌菌株的生物量 65
2.2 蛹拟青霉不同菌株的富锌能力 65-66
3 讨论与结论 66-67
第三节 蛹拟青霉高富锗菌株的筛选 67-74
1 材料与方法 67-70
1.1 材料 67-69
1.2 方法 69-70
2 结果与分析 70-72
2.1 蛹拟青霉富锗菌株的生物量 70
2.2 蛹拟青霉不同菌株的富锗能力 70-72
3 讨论与结论 72-73
本章小节 73-74
第四章 硒、锌、锗元素在蛹拟青霉菌丝体内的分布研究 74-84
1 材料与方法 74-78
1.1 菌种及其来源 74
1.2 培养基 74
1.3 主要化学试剂 74-75
1.4 主要仪器 75
1.5 实验方法 75-78
2 结果与分析 78-82
2.1 硒在菌丝体蛋白质、多糖和核酸中的含量分布 78-79
2.2 锌在菌丝体蛋白质、多糖和核酸中的含量分布 79-81
2.3 锗在菌丝体蛋白质、多糖和核酸中的含量分布 81-82
3 讨论与结论 82-84
第五章 硒、锌、锗对蛹拟青霉主要活性成分的影响 84-110
第一节 硒对蛹拟青霉菌丝体主要活性成分的影响 85-96
1 材料与方法 85-90
1.1 材料 85-87
1.2 方法 87-90
2 结果与分析 90-95
2.1 硒对蛹拟青霉富硒菌丝体生物量的影响 90-91
2.2 硒对蛹拟青霉富硒菌丝体胞内多糖含量的影响 91
2.3 硒对蛹拟青霉菌丝体硒含量和有机硒转化率的影响 91-92
2.4 硒对蛹拟青霉菌丝体蛋白质含量的影响 92-93
2.5 硒对蛹拟青霉菌丝体氨基酸含量的影响 93-94
2.6 硒对蛹拟青霉菌丝体SOD酶活力的影响 94
2.7 硒对蛹拟青霉菌丝体虫草素含量的影响 94-95
3 讨论与结论 95-96
第二节 锌对蛹拟青霉菌丝体主要活性成分的影响 96-103
1 材料与方法 96-98
1.1 材料 96-97
1.2 方法 97-98
2 结果与分析 98-102
2.1 锌对蛹拟青霉富锌菌丝体生物量的影响 98-99
2.2 锌对蛹拟青霉富锌菌丝体胞内多糖含量的影响 99
2.3 锌对蛹拟青霉菌丝体锌含量和有机锌转化率的影响 99-100
2.4 锌对蛹拟青霉菌丝体蛋白质含量的影响 100-101
2.5 锌对蛹拟青霉菌丝体氨基酸含量的影响 101
2.6 锌对菌丝体SOD活性的影响 101-102
2.7 锌对菌丝体虫草素含量的影响 102
3 讨论与结论 102-103
第三节 锗对蛹拟青霉菌丝体主要活性成分的影响 103-110
1 材料与方法 103-105
1.1 材料 103-104
1.2 方法 104-105
2 结果与分析 105-108
2.1 锗对蛹拟青霉菌丝体生物量的影响 105
2.2 锗对蛹拟青霉菌丝体胞内多糖量的影响 105-106
2.3 锗对蛹拟青霉菌丝体锗含量和有机锗转化率的影响 106
2.4 锗对蛹拟青霉菌丝体蛋白质含量的影响 106-107
2.5 锗对蛹拟青霉菌丝体氨基酸含量的影响 107-108
2.6 锗对菌丝体SOD活力的影响 108
2.7 锗对菌丝体虫草素含量的影响 108
3 讨论与结论 108-110
第六章 富硒、锌、锗蛹拟青霉抗氧化、抗衰老作用研究 110-122
1 材料与方法 110-113
1.1 材料 110-111
1.1.1 菌种及其来源 110
1.1.2 培养基 110-111
1.1.3 主要试剂 111
1.1.4 主要设备 111
1.2 实验方法 111-113
2 结果与分析 113-119
2.1 多糖中有机硒、锌、锗及多糖含量 113-114
2.2 硒、锌、锗多糖对超氧自由基的清除作用 114
2.3 硒、锌、锗多糖对羟自由基的清除作用 114-115
2.4 硒、锌、锗多糖对DPPH的清除作用 115
2.5 富硒、锌、锗菌丝体对果蝇体内SOD含量的影响 115-116
2.6 富硒、锌、锗菌丝体对果蝇体内MDA含量的影响 116-117
2.7 硒、锌、锗多糖对果蝇寿命的影响 117-119
3 讨论与结论 119-122
第七章 富硒、锌、锗蛹拟青霉菌丝体抗疲劳能力研究 122-142
第一节 富硒蛹拟青霉菌丝体抗疲劳能力研究 122-128
1 材料与方法 123-124
1.1 材料 123
1.2 方法 123-124
1.3 数据处理 124
1.4 结果判定 124
2 结果与分析 124-126
2.1 富硒蛹拟青霉对小鼠负重游泳力竭时间的影响 124-125
2.2 富硒蛹拟青霉对小鼠血乳酸含量的影响 125-126
2.3 富硒蛹拟青霉对小鼠尿素氮含量的影响 126
2.4 富硒蛹拟青霉对小鼠常压耐缺氧能力的影响 126
3 讨论与结论 126-128
第二节 富锌蛹拟青霉菌丝体抗疲劳能力研究 128-132
1 材料与方法 128-129
2 结果与分析 129-130
2.1 富锌蛹拟青霉对小鼠负重游泳力竭时间的影响 129
2.2 富锌蛹拟青霉对小鼠血乳酸含量的影响 129-130
2.3 富锌蛹拟青霉对小鼠尿素氮含量的影响 130
2.4 富锌蛹拟青霉对小鼠常压耐缺氧能力的影响 130
3 讨论与结论 130-132
第三节 富锗蛹拟青霉菌丝体抗疲劳能力研究 132-135
1 材料与方法 132
2 结果与分析 132-134
2.1 富锗蛹拟青霉对小鼠负重游泳力竭时间的影响 133
2.2 富锗蛹拟青霉对小鼠血乳酸含量的影响 133
2.3 富锗蛹拟青霉对小鼠尿素氮含量的影响 133-134
2.4 富锗蛹拟青霉对小鼠常压耐缺氧能力的影响 134
3 讨论与结论 134-135
第四节 富硒、锌、锗蛹拟青霉菌丝体抗疲劳能力的比较分析 135-142
1 三种菌丝体对小鼠负重游泳时间影响的比较分析 135
2 三种菌丝体对小鼠血乳酸含量影响的比较分析 135-137
3 三种菌丝体对小鼠血尿素氮含量影响的比较分析 137-139
4 三种菌丝体对小鼠耐缺氧能力影响的比较分析 139
5 结论 139-142
第八章 富硒、锌、锗蛹拟青霉多糖抗突变作用研究 142-150
1 材料与方法 142-143
1.1 材料 142-143
1.2 实验方法 143
1.3 分析方法 143
2 结果与分析 143-147
2.1 多糖中有机硒、锌、锗及多糖含量 143
2.2 富硒、锌、锗多糖对丝裂霉素诱发蚕豆根尖细胞微核的影响 143-146
2.3 富硒、锌、锗多糖对紫外线诱发蚕豆根尖细胞微核的影响 146-147
3 讨论与结论 147-150
第九章 富硒、锌、锗蛹拟青霉胞内多糖抗肿瘤功能研究 150-156
1 材料与方法 150-151
1.1 材料 150-151
1.2 实验方法 151
2 结果与分析 151-153
2.1 富硒、锌、锗蛹拟青霉菌丝体胞内多糖对肺腺癌A549细胞株的抑制作用 151-152
2.2 富硒、锌、锗蛹拟青霉菌丝体胞内多糖对鼻咽癌CNE-1细胞株的抑制作用 152-153
3 讨论与结论 153-156
第十章 富硒、锌、锗蛹拟青霉菌丝体急性毒理评价 156-158
1 材料和方法 156
1.1 实验材料 156
1.2 实验方法 156
2 结果与分析 156-157
3 讨论与结论 157-158
第十一章 结论 158-160
创新点 160-162
参考文献 162-176
致谢 176-178
个人简介 178-180
在读博士期间发表的学术论文 180-181
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