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久效磷对马粪海胆（Hemicentrotus pulcherrimus）胚胎发育神经毒性效应研究

作　者: 姚丹
导　师: 汝少国；加藤秀生
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物
关键词: 久效磷马粪海胆发育神经毒性血清素多巴胺
分类号: X174
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

近年来,关于有机磷农药发育神经毒性的研究备受关注。久效磷作为一种高毒有机磷杀虫剂,由于具有水溶性特点,易在水环境中残留,对环境污染严重,甚至威胁着动植物乃至人类的健康。越来越多的研究表明有机磷农药对神经细胞复制和分化、轴突和树突的发生、乃至树突功能的影响都将导致行为上的缺陷。海胆的早期胚胎发育是研究农药胚胎和神经毒性的理想生物模型。因此,本文以马粪海胆胚胎和幼虫为实验材料,通过观察久效磷暴露条件下幼虫的形态发生和泳动行为,研究其对血清素和前多巴胺能系统调节功能的影响；采用整体免疫组化技术,从神经元形态发生的水平上,研究了久效磷对血清素顶系神经节及其受体细胞网络的抑制作用；并进一步探讨了血清素神经节异常情况下,轴突导向因子—HpNetrin的时空分布情况。主要研究结果如下：(1)形态学方面,久效磷会导致H.pulcherrimus幼虫腕长和体长的短小；运动行为方面,久效磷暴露条件下扰乱幼虫向上泳动的行为,甚至导致泳动能力的丧失,具有剂量-效应关系。(2)久效磷能够延迟早期神经发育进程,表现为减少血清素能神经细胞的数量和显著地抑制轴突的生长；血清素能神经元形态发生异常,特别是SRCN的重要组成部分口突横向纤维(oltort)的缺失,间接导致了血清素受体细胞网络(SRCN)的紊乱。(3)从10μg/ml久效磷暴露组开始HpNetrin在时间和空间上的表达异常,主要体现在棱柱幼虫时期动物极处无HpNetrin的富集,二腕幼虫时期沿纤毛带分布的HpNetrin信号较弱。采用免疫印迹技术对对照、10μg/ml和30μg/ml久效磷暴露组中HpNetrin蛋白从15-hpf到48-hpf阶段的表达量的半定量分析结果表明：久效磷扰乱了HpNetrin的表达模式,表现为15-hpf表达量较高,随后表达量逐渐降低,RT-PCR结果和免疫印迹结果相一致,说明久效磷从基因表达水平上扰乱了HpNetrin的表达。(4)0.1μg/ml久效磷暴露使绝大多数胚胎单细胞丧失重聚的能力,单细胞震动频率变小,但仍然存活；结合EpithⅡ免疫染色和台盼蓝染色法,我们发现久效磷对细胞膜具有较强的破坏作用；久效磷对重聚细胞团的毒性作用还表现在对血清素能神经元发生的影响。0.1μg/ml久效磷暴露后,仍然可以在重聚细胞团内检测到血清素细胞的阳性信号,但是无法检测到血清素受体细胞形成的神经纤维束结构,说明胚胎重组细胞模型可以用来检测血清素细胞的发生及其轴突的生长情况,而海胆幼体则更适合于研究久效磷对血清素受体细胞网络形成的影响。(5)久效磷暴露条件下,浮游囊胚期能够检测到DRD1阳性信号,但是与对照组相比颗粒数较少,而且分布不规则。通过Brdu免疫组化实验证明,48-hpf时延纤毛带分布的DRD1增殖数量显著降低,表明久效磷对多巴胺受体DRD1的时空表达具有抑制作用。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
0 前言  12-14
1. 有机磷农药的神经毒性研究进展  14-29
  1.1 海胆胚胎的早期发育  14-19
    1.1.1 胚胎发育过程  14-16
    1.1.2 海胆胚胎的早期神经发育  16-18
    1.1.3 海胆胚胎发育模型的优势  18-19
  1.2 有机磷农药的神经毒性机制  19-22
    1.2.1 对脑神经元的影响  19-20
    1.2.2 对神经胶质细胞的影响  20
    1.2.3 对胆碱能递质系统的影响  20-21
    1.2.4 对儿茶酚胺类神经递质系统的影响  21
    1.2.5 对吲哚胺P类神经递质系统的影响  21
    1.2.6 对信号传到途径的影响  21-22
  1.3 农药对海胆配子和早期胚胎发育毒性效应  22-27
    1.3.1 海胆配子模型在农药毒性研究中的应用  22-23
    1.3.2 农药对海胆胚胎有丝分裂的影响  23-25
    1.3.3 农药对胚胎及幼虫形态发生的扰乱作用  25-26
    1.3.4 扰乱乙酰胆碱酯酶的活性分布  26-27
  1.4 研究目的和技术路线  27-29
2 久效磷对马粪海胆幼虫形态发生和行为的影响  29-38
  2.1 材料与方法  30-31
    2.1.1 实验动物的来源与培养  30
    2.1.2 实验浓度设定与配制  30
    2.1.3 碱性磷酸酶(AP)染色法  30-31
    2.1.4 二腕幼虫直立泳动实验  31
    2.1.5 统计分析  31
  2.2 结果与分析  31-35
    2.2.1 久效磷对海胆胚胎的48h致死浓度曲线  31-32
    2.2.2 久效磷对马粪海胆胚胎骨骼发育的影响  32-34
    2.2.3 久效磷对海胆幼虫泳动行为的影响  34-35
  2.3 讨论  35-37
  2.4 小结  37-38
3 久效磷对马粪海胆血清素能神经系统的影响  38-50
  3.1 材料与方法  39-40
    3.1.1 实验动物  39
    3.1.2 久效磷的暴露方法  39
    3.1.3 血清素及血清素受体的整体免疫组化定位  39-40
    3.1.4 棱柱和长腕幼虫时期血清素受体蛋白表达的半定量分析  40
  3.2 结果  40-48
    3.2.1 久效磷对海胆幼虫SAG发生的影响  40-43
    3.2.2 久效磷对幼虫血清素受体细胞网络的影响  43-46
    3.2.4 久效磷对血清素受体细胞蛋白表达量的影响  46-48
  3.3 讨论  48-49
  3.4 小结  49-50
4 久效磷对神经导向因子-HpNtcrni时空分布与表达的影响  50-66
  4.1 材料与方法  51-53
    4.1.1 实验动物  51
    4.1.2 久效磷的暴露方法  51-52
    4.1.3 血清素及HPNetrin的整体免疫组化定位  52
    4.1.4 海胆早期胚胎发育阶段Netrin蛋白表达量的半定量分析  52-53
    4.1.5 海胆早期胚胎发育阶段Netrin基因表达量的半定量分析  53
  4.2 结果  53-63
    4.2.1 久效磷对Netrin蛋白表达模式的影响  53-55
    4.2.2 久效磷暴露条件下HPNetrin与血清素(5-HT)时空表达关系  55-58
    4.2.3 久效磷对HPNetrin蛋白表达量的影响  58-60
    4.2.4 久效磷对HpNetrin基因表达量的影响  60-63
  4.3 讨论  63-64
  4.4 小结  64-66
5 以海胆胚胎重聚细胞为模型的久效磷毒性效应研究  66-78
  5.1 材料与方法  67-69
    5.1.1 实验动物  67
    5.1.2 久效磷暴露方法  67
    5.1.3 细胞培养液的制备  67-68
    5.1.4 血清素及其受体的双染色法  68
    5.1.5 EpithⅡ组织染色法  68-69
    5.1.6 台盼蓝(Trypan Blue)染色法  69
  5.2 结果  69-75
    5.2.1 久效磷抑制胚胎细胞重聚  69
    5.2.2 久效磷导致重聚细胞团细胞膜的破裂  69-71
    5.2.3 久效磷对重聚细胞团内血清素及其受体表达的影响  71-73
    5.2.4 久效磷对重聚细胞团内血清素轴突介导蛋白HpNetrin表达的影响  73-75
  5.3 讨论  75-76
  5.4 小结  76-78
6 久效磷对马粪海胆幼虫多巴胺受体DRD_1时空表达的影响  78-89
  6.1 材料与方法  78-81
    6.1.1 实验动物  78-79
    6.1.2 久效磷的暴露方法  79
    6.1.3 棱柱幼虫直立泳动实验  79
    6.1.4 多巴胺受体DRD_1整体免疫组化定位  79-80
    6.1.5 溴脱氧尿苷(BrdU)染色法  80-81
  6.2 结果  81-86
    6.2.1 久效磷对初期棱柱幼虫泳动行为的影响  81
    6.2.2 久效磷对多巴胺受体DRD_1时空表达的的影响  81-84
    6.2.3 久效磷对沿纤毛带的细胞增殖的影响  84-86
  6.3 讨论  86-87
  6.4 小结  87-89
结论  89-90
参考文献  90-103
文中主要缩略语  103-104
已发表或待发表的论文  104-105
致谢  105

久效磷对马粪海胆（Hemicentrotus pulcherrimus）胚胎发育神经毒性效应研究

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