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葡萄体细胞胚的诱导及中国野葡萄芪合成酶基因VpSTSgDAN2转化研究

作　者: 肖宇
导　师: 王跃进
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 园艺植物种质资源学
关键词: 葡萄 体细胞胚发生 农杆菌介导 芪合成酶 启动子
分类号: S663.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


芪合成酶（stilbene synthase,STS）基因及其特异启动子为本课题组前期从中国野生华东葡萄白河-35-1中克隆得到的抗病相关基因。本研究将芪合成酶基因置于增添不同增强子的该启动子下,构建4个植物表达载体,旨在利用基因工程技术,将其转入感病欧洲葡萄基因组中,为获得抗病性明显提高的转基因植株提供理论与技术依据。在以‘佳利酿’、‘无核白’、‘火焰无核’、‘长穗无核白’、‘赤霞珠’的花器官为外植体进行体细胞胚诱导与成苗研究的基础上,通过农杆菌介导法,将携带有中国野生葡萄芪合成酶基因及其特异启动子的植物表达载体转入番茄和葡萄中,取得的主要结果如下:1.以5个种欧洲葡萄品种‘佳利酿’、‘无核白’、‘火焰无核’、‘长穗无核白’、‘赤霞珠’的雄蕊、雌蕊和小花蕾为外植体,在4种不同的培养基上诱导愈伤,其中培养基NN69 + 2.0 mg·L-1 6-BA + 1.0 mg·L-1 2,4-D + 60 g·L-1蔗糖+ 3 g·L-1 phatagel和培养基MS + 0.55 mg·L-1 2,4-D + 0.5 mg·L-1 NOA+1.24 mg·L-1 4-CPPU + 30 g·L-1蔗糖+ 3 g·L-1 phatagel对花器官外植体胚性愈伤的诱导比较有利,诱导率最高可达6.2%。2.所研究的5个欧洲葡萄品种,除了‘赤霞珠’外,其余4个品种经花器官诱导出的愈伤均可在培养基X6 + 60 g·L-1蔗糖+ 7 g·L-1TC-Agar + 0.5 g·L-1AC中进一步诱导出体细胞胚。而且对于发育时期在心型胚之前的体细胞胚可以在X6培养基中继代保存,产生次生胚。3.体细胞胚在液体的MS培养基中110rpm 25℃暗培养1w后转移到成苗培养基WPM+ 0.15 mg·L-1IBA + 30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂+ 0.5 g·L-1AC中,先弱光培养3 d后置于强光照下培养,1 w左右即可成苗。4.利用农杆菌介导法,将含有中国野葡萄芪合成酶基因及其特异启动子的载体转入番茄Micro-Tom中,经初步的PCR和PCR-Southern检测共获得了51株转基因苗。5.通过高效液相色谱对番茄转基因植株和野生型植株接种番茄灰霉病24 h后白藜芦醇含量的测定,结果表明含有增强元件Enhancer的转化植株白藜芦醇含量最高,是不添加任何增强元件的载体gD2转化的番茄白藜芦醇含量的4.4倍。野生型植株均未检测到白藜芦醇。6.通过接种番茄灰霉病,测定其病情指数,结果表明转基因番茄抗病性都有一定提高,其中含有增强元件Enhancer的增强载体转化的番茄抗病性最强。

全文目录


摘要  6-7
ABSTRACT  7-11
第一章 文献综述  11-20
  1.1 葡萄再生体系研究进展  11-15
    1.1.1 葡萄体细胞胚发生途径  12-14
    1.1.2 葡萄器官发生途径  14-15
  1.2 葡萄遗传转化研究方法  15-17
    1.2.1 农杆菌介导的遗传转化  15-17
    1.2.2 基因枪法介导的遗传转化  17
  1.3 芪合成酶基因及其特异启动子的研究进展  17-18
  1.4 模式生物在生物学发展中的作用  18-19
  1.5 本研究目的与意义  19-20
第二章 葡萄再生体系的建立及遗传转化研究  20-32
  2.1 材料  20-21
    2.1.1 植物材料  20
    2.1.2 植物表达载体  20
    2.1.3 主要试剂  20
    2.1.4 仪器设备  20-21
  2.2 方法  21-23
    2.2.1 葡萄体细胞胚的诱导  21-22
    2.2.2 体细胞胚的发生及次生胚的诱导  22
    2.2.3 体细胞胚的萌发和成苗  22
    2.2.4 农杆菌介导的葡萄体细胞胚的遗传转化  22-23
    2.2.5 抗性植株的检测  23
  2.3 结果与分析  23-28
    2.3.1 葡萄体细胞胚的诱导  23-25
    2.3.2 体细胞胚的发生和发育时期的观察  25-27
    2.3.3 次生胚的诱导  27
    2.3.4 体细胞胚的萌发和成苗  27-28
    2.3.5 农杆菌介导葡萄体细胞胚的遗传转化  28
  2.4 讨论  28-32
    2.4.1 葡萄体细胞胚再生体系的建立  28-30
    2.4.2 农杆菌介导的葡萄遗传转化  30-32
第三章 芪合成酶基因及其特异启动子转化番茄的研究  32-43
  3.1 材料  32
    3.1.1 植物材料  32
    3.1.2 植物表达载体  32
    3.1.3 主要试剂  32
    3.1.4 仪器设备  32
  3.2 方法  32-35
    3.2.1 农杆菌介导的番茄遗传转化  32-33
    3.2.2 转基因番茄的检测  33
    3.2.3 转基因番茄的抗病性试验  33-35
    3.2.4 转基因番茄白藜芦醇含量的测定  35
  3.3 结果与分析  35-41
    3.3.1 农杆菌介导的番茄遗传转化  35-36
    3.3.2 抗性番茄植株的检测  36-37
    3.3.3 转基因番茄的抗病性试验  37-38
    3.3.4 转基因番茄白藜芦醇含量的测定  38-41
  3.4 讨论  41-43
    3.4.1 关于芪合成酶及其特异启动子的研究  41-42
    3.4.2 增强子对基因表达的作用  42-43
第四章 结论  43-44
参考文献  44-52
附录  52-54
缩略词  54-55
致谢  55-57
作者简介  57

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 浆果类 > 葡萄
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