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竹类植物生长发育过程中的DNA甲基化研究

作　者: 郭广平
导　师: 顾小平
学　校: 中国林业科学研究院
专　业: 生态学
关键词: 竹类植物表观遗传学 DNA甲基化生理年龄开花
分类号: S795
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

为探究竹类植物生长发育过程中的表观遗传现象,采用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)和高效液相色谱(HPLC)技术对不同生理年龄的毛竹(Phyllostachys heterocycla var. pubescens)、开花与未开花的孝顺竹(Bambusa. multiplex)、以及同一生理起源、不同生境下的黄秆乌哺鸡竹(Ph.vivax f.aureocaulis)的幼嫩叶片进行了基因组DNA甲基化检测,得到如下结论:1、毛竹基因组DNA甲基化水平随生理年龄的增加呈上升趋势。选择5年、31年及﹥60年生的毛竹林分,采用35对引物组进行MSAP分析发现:在毛竹营养生长过程中,随生理年龄的增加,基因组同时发生DNA的甲基化和去甲基化现象,其中发生甲基化的变异位点(52.3%)远大于去甲基化变异位点(10.3%),从而使基因组DNA甲基化率随年龄的增加呈现上升趋势,方差分析显示:同一林分的毛竹单株(包括同一出笋年龄和不同出笋年龄的毛竹单株)基因组DNA甲基化水平没有显著差异,但不同生理年龄的毛竹林分间差异达到了极显著水平(P<0.001)。2、筛选6对引物组合,建立了MSAP技术下的毛竹基因组DNA甲基化与生理年龄的回归模型。对实验采用的35对引物组合进行统计分析,筛选了随毛竹生理年龄增加DNA甲基化水平增加,而且每相邻两个年龄间差异达到极显著水平的6对引物组合(E+CA/HM+CAC、E+CA/HM+CTC、E+CA/HM+CTG、E+AG/HM+CTA、E+AG/HM+CTC、E+AA/HM+CTA)。将筛选的6对引物进行主成分分析,通过累积贡献率大于90%以及特征根大于1这两个条件,确定各对引物在判识毛竹生理年龄中的权重,得到一个综合指标,即:Y=0.173x1+0.172x2+0.172x3+0.178x4+0.176x5+0.180x6,用以代表毛竹随生理年龄变化的基因组DNA总甲基化水平。随后选择2年、6年、13年、18年、32年和﹥60年生等6个年龄段毛竹林分,采用上述的6对引物进行MSAP检测。对统计数据进行模型拟合,得到毛竹生理年龄与其基因组DNA甲基化率的二次回归模型:Z =0.542y2+0.003y+17.999,R2=0.970。这对野外毛竹林分的生理年龄判定具有重要的实践意义。3、孝顺竹由营养生长转生殖生长时基因组DNA甲基化水平明显降低采用HPLC技术对孝顺竹开花前后的基因组DNA甲基化进行了研究,结果发现:孝顺竹在未开花的生长发育过程中,DNA甲基化率呈现不规则的波动现象。方差分析显示:无论是同一竹丛不同时期,还是相同时期不同竹丛DNA甲基化率均无显著差异(P =0.109﹥0.05和P =0.622﹥0.05)。对孝顺竹同一丛内(同一无性系)开花与未开花单株的MSAP检测,结果发现:开花竹株的DNA甲基化变异条带占了总条带数的33.17%,其中发生甲基化的位点(22.28%)远大于去甲基化位点(1.98%),导致开花植株DNA的甲基化率显著低于未开花植株,差异达到了极显著水平(P<0.001)。对开花与未开花竹株的同一样品分别采用HPLC和MSAP技术检测DNA甲基化,结果发现:HPLC检测的总甲基化率(开花26.69%;未开花30.61%)显著高于MSAP检测结果(开花9.00%;未开花12.42%),但趋势一致。这主要与HPLC技术能够测定基因组整体DNA甲基化水平,而MSAP技术只能对全基因组的胞嘧啶甲基化水平进行分析的特点有关。4、同一生理起源、不同生境下的黄秆乌哺鸡竹有随地理纬度的降低,DNA甲基化水平逐渐降低的现象。黄秆乌哺鸡是乌哺鸡竹的变种,于1982年在浙江省安吉竹博园被发现,因观赏价值高,现已扩繁引种到全国的许多地区。对采自北京良乡、江苏南京、浙江安吉、江西南昌、四川长宁、广东南雄,共6个地区的黄秆乌哺鸡竹基因组DNA进行了研究。首先,采用AFLP技术对6个地区的样品进行的遗传多样性分析表明:同一无性起源、不同生境下的黄秆乌哺鸡竹叶片基因组DNA序列无明显差异;但经MSAP检测发现:不同地区DNA总甲基化率和全甲基化率分别为:北京良乡(33.62%和19.57%)、江苏南京33.19%和19.27%)、浙江安吉(31.19%1和8.60%)、江西南昌(30.93%和18.01%)、四川长宁(29.50%和16.32%)、广东南雄(28.78%和14.49%),有随地理纬度的降低DNA甲基化水平呈现降低的趋势。另外,将筛选的与毛竹生理年龄相关的6对引物组合应用于黄秆乌哺鸡竹的MSAP检测发现:不同地区黄秆乌哺鸡竹MSAP扩增条带一致,无显著差异,即同一无性起源、不同生境下的黄秆乌哺鸡竹基因组DNA未发生明显甲基化变异。这也从另一角度验证了,筛选的6对引物组合在竹类植物生理年龄判识中的可行性。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-14
第一章绪论  14-27
  1.1 引言  14-24
    1.1.1 研究背景  14-15
    1.1.2 国内外研究现状  15-24
  1.2 本研究目的意义及研究内容  24-27
    1.2.1 研究的目的意义  24
    1.2.2 主要研究内容  24-26
    1.2.3 研究技术路线  26-27
第二章材料与方法  27-37
  2.1 试验材料  27-28
  2.2 主要仪器和试剂  28-29
    2.2.1 主要仪器  28
    2.2.2 试剂配置  28-29
  2.3 实验方法  29-37
第三章结果与分析  37-68
  3.1 方法体系的建立  37-42
    3.1.1 MSAP 和AFLP 体系的建立  37-39
    3.1.2 HPLC 体系建立  39-41
    3.1.5 小结与讨论  41-42
  3.2 毛竹生理年龄与基因组 DNA 甲基化水平的相关性  42-49
    3.2.1 不同生理年龄间毛竹基因组 DNA 甲基化分析  42-43
    3.2.2 同一林分不同出笋年龄间毛竹基因组 DNA 甲基化分析  43-45
    3.2.3 不同生理年龄间毛竹基因组 DNA 甲基化带型分析  45-48
    3.2.4 小结与讨论  48-49
  3.3 基于特定引物组合进行毛竹生理年龄与DNA 甲基化相关性模型建立  49-55
    3.3.1 MSAP 检测过程中扩增引物组合的分析  49-50
    3.3.2 基于物定引物组合的 MSAP 检测结果进行综合因子确定  50-52
    3.3.3 毛竹生理年龄与基因组 DNA 甲基化水平间的初步模型建立  52-54
    3.3.4 小结与讨论  54-55
  3.4 孝顺竹开花过程中基因组 DNA 甲基化变化规律  55-63
    3.4.1 孝顺竹开花过程中基因组 DNA 总甲基化水平的 HPLC 分析  55-57
    3.4.2 基于 MSAP 的孝顺竹开花与未开花单株的 DNA 甲基化水平分析  57-58
    3.4.3 孝顺竹开花与未开花状态下 DNA 甲基化带型分析  58-59
    3.4.4 毛竹年龄相关的特定引物组与孝顺开花  59-61
    3.4.5 小结与讨论  61-63
  3.5 不同生境的黄秆乌哺鸡竹的 AFLP 和 MSAP 分析  63-68
    3.5.1 不同生境下黄秆乌哺鸡竹的遗传多样性分析  63-64
    3.5.2 不同地区黄秆乌哺鸡竹基因组 DNA 总甲基化水平分析  64-67
    3.5.3 不同地理环境条件下毛竹年龄相关的特定引物组合的扩增情况  67
    3.5.4 小结与讨论  67-68
第四章结论与讨论  68-74
  4.1 结论  68-69
  4.2 讨论  69-72
    4.2.1 MSAP 与HPLC 技术比较  69-70
    4.2.2 DNA 甲基化与竹类植物年龄的关系  70-71
    4.2.3 DNA 甲基化与竹类植物的开花  71
    4.2.4 DNA 甲基化受环境影响的变异  71-72
    4.2.5 特异片段分析  72
  4.3 展望  72-74
参考文献  74-81
在读期间的学术研究  81-82
致谢  82

竹类植物生长发育过程中的DNA甲基化研究

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