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马泰勒虫分类学定位佐证及PCR、ELISA检测方法的建立

作　者: 罗金
导　师: 刘光远；孙晓林
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 马梨形虫病分类学地位 PCR诊断方法 ELISA诊断方法
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

马属动物梨形虫包括马泰勒虫（Theileria equi ,旧称马巴贝斯虫Babesia equi）和驽巴贝斯虫（Babesia caballi）,其隶属于顶器复合门、孢子虫纲、梨形虫目的泰勒科、泰勒属和巴贝斯科的巴贝斯属。病原寄生于马属动物红细胞内,是一种蜱传播性血液原虫病。流行区域主要包括欧洲、非洲、美洲、亚洲以及澳大利亚等大部分地区,具有一定的区域性和季节性,多分布于热带、亚热带,温带地区也有相关报道。在我国东北、西北、华北等地区均有马梨形虫病感染的报道。多年来马泰勒虫的分类学地位一直存在争议,多数文献以及教科书上都将其命名为马巴贝斯虫,而一些人则将其更名为马泰勒虫。而常用的分类鉴别方法和血清学方法都没有能够很好的对该虫种进行分类学的定位。国内虽然有关于马泰勒虫病检测方法的报道,但其病原虫种并非我国境内虫株,其产权也非我国所有,因此有必要对我国马泰勒虫病原体的分类学特征及相关自主知识产权的诊断方法展开研究。本研究用分离自我国的马泰勒虫和驽巴贝斯虫进行动物接种培养,采集含虫血,提取虫体基因组DNA。并根据GenBank上报道的马梨形虫18S rRNA、马泰勒虫Hsp70和EMA1基因,设计引物,利用PCR方法分别获得了相应大小的核苷酸片段,将扩增产物克隆于pGEM-T easy载体,PCR鉴定阳性模板用于核苷酸序列测定。结果显示获得的马泰勒虫18S rRNA核苷酸片段大小为913bp,驽巴贝斯虫18S rRNA核苷酸片段大小为452bp,马泰勒虫Hsp70核苷酸片段大小为1920bp,EMA1核苷酸片段大小为819bp。利用以上序列分别建立物种间的种系发生树,同时利用18S rRNA序列特征建立了马泰勒虫和驽巴贝斯虫PCR诊断方法。利用EMA1基因建立了马泰勒虫ELISA诊断方法。18S rRNA作为分类学鉴定的标志性基因序列,已经在多个物种的分离鉴定中得应用。本试验基于该基因的V4高变区对我国马梨形虫的分类学定位进行研究,发现之前称为马巴贝斯（Babesia equi）的虫种和泰勒虫种有着更为密切的关系,它们处于同一分支,而与巴贝斯虫种处于明显的两个分支,这与之前将马泰勒虫定名为马巴贝斯虫的说法完全相悖。同时发现我国马梨形虫与西班牙马梨形虫亲缘关系最近。为了进一步验证这一结果,同时克隆了马泰勒虫的Hsp70基因,系统发育分析结果与18S rRNA为基础研究的结果是一致的。以上研究结果从不同角度佐证了我国马泰勒虫在国际分类学中的地位并从分子进化角度诠释了马巴贝斯虫（旧称）隶属于泰勒虫科,泰勒虫属这一事实,该种的正确命名应为马泰勒虫。马梨形虫对我国乃至世界马属动物产业的发展有着极其严重的危害,而我国依然没有自主知识产权的产品应用于马梨形虫病的诊断。本试验利用获得的马梨形虫18S rRNA建立了马梨形虫病的PCR诊断方法。PCR结果显示,利用马泰勒虫特异性引物检测马泰勒虫、驽巴贝斯虫、尤氏泰勒虫、中华泰勒虫、环形泰勒虫、绵阳泰勒虫、吕氏泰勒虫、瑟氏泰勒虫时仅有马泰勒虫模板检测为阳性。而用驽巴贝斯虫特异性引物检测驽巴贝斯虫、马泰勒虫、双芽巴贝斯虫、莫氏巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫时也仅有驽巴贝斯虫模板及混合样本为阳性,各自的引物分别对马泰勒虫或驽巴贝斯虫没有交叉反应。敏感性试验中,对定量到100ng/ul马梨形虫基因组模板进行扩增显示,马泰勒虫和驽巴贝斯虫的检出率分别为10^-13、10^-10。该方法和常规的显微镜镜检方法对54份田间样品检测结果表明,PCR方法比显微镜法检测有着更高的检出率。常规的分子诊断方法已经不能满足于大批量的田间样品检测的需求,因此寻找好的抗原建立血清学诊断方法就显得尤为重要。马泰勒虫表面裂殖子抗原（Equi Merozoite Antigen 1 EMA1）具备候选疫苗的特点,因此我们对该基因进行了克隆和表达,Western blot分析,该重组蛋白能被标准马泰勒虫阳性血清所识别。基于此建立的马泰勒虫病ELISA诊断方法,也同样成功检测了马泰勒虫的感染情况。对比PCR检测方法和显微镜镜检方法,ELISA方法明显高于显微镜镜检方法,与PCR方法相比,ELISA方法具有检测快速,样本量大的特点。这为以后防控该病的潜在疫苗研制奠定了良好的基础。综上所述,我国马泰勒虫分类地位的研究,及马巴贝斯虫准确分类命名的佐证,为今后该疫病的研究和防控起到一定的指导意义。同时马泰勒虫病PCR和ELISA诊断方法的初步建立,将为我国生产具有自主知识产权的诊断试剂盒奠定基础。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
第一章综述  10-18
  1.1 研究目的和意义  10
  1.2 马泰勒虫分类学地位研究现状  10-13
    1.2.1 国内外研究现状  11-12
    1.2.2 虫种分类学研究的意义  12-13
  1.3 马梨形虫诊断方法的研究现状  13-18
    1.3.1 病原组织学诊断  13-14
    1.3.2 免疫学诊断  14-15
    1.3.3 分子生物学诊断  15-18
第二章基于18S rRNA 序列的马梨形虫分类学地位分析  18-28
  2.1 材料和方法  19-24
    2.1.1 虫株及主要试剂  19
    2.1.2 培养基的制备  19
    2.1.3 主要仪器  19-20
    2.1.4 方法  20-24
  2.2 结果  24-25
    2.2.1 18S rRNA 基因的扩增  24
    2.2.2 系统发育分析  24-25
  2.3 讨论  25-28
第三章基于Hsp70 基因的马梨形虫分类学定位分析  28-37
  3.1 材料与方法  29-31
    3.1.1 虫株及试剂  29
    3.1.2 引物设计与合成  29
    3.1.3 目的基因的获得及克隆  29-30
    3.1.4 序列分析与系统发生树的建立  30-31
  3.2 结果  31-35
    3.2.1 马泰勒虫Hsp70 基因的扩增  31
    3.2.2 系统发生树进化分析  31-32
    3.2.3 同源性分析  32-35
  3.3 讨论  35-37
第四章马梨形虫病PCR 检测方法建立和应用  37-45
  4.1 材料和方法  37-40
    4.1.1 虫株与感受态菌株  37-38
    4.1.2 主要试剂及仪器设备  38
    4.1.3 方法  38-40
  4.2 结果  40-43
    4.2.1 马梨形虫18S rRNA 基因片段的扩增  40
    4.2.2 PCR 灵敏度试验  40-41
    4.2.3 PCR 特异性试验  41-43
    4.2.4 田间样品的检测  43
  4.3 讨论  43-45
第五章基于EMA1 基因的马泰勒虫病ELISA 诊断方法的建立  45-67
  5.1 材料与方法  46-48
    5.1.1 载体和菌株  46
    5.1.2 工具酶和试剂  46-47
    5.1.3 培养基  47
    5.1.4 试验仪器  47-48
  5.2 试验方法  48-56
    5.2.1 引物设计原则  48
    5.2.2 引物的设计与合成  48-49
    5.2.3 目的片段的扩增  49
    5.2.4 目的基因的克隆  49-50
    5.2.5 重组质粒的提取和鉴定  50-52
    5.2.6 表达载体的构建与鉴定  52
    5.2.7 目的片段与表达载体的连接转化  52-53
    5.2.8 重组表达质粒的提取与鉴定  53
    5.2.9 重组质粒的诱导表达  53
    5.2.10 表达产物的检测  53-55
    5.2.11 重组表达产物的Western-blotting 检测  55-56
  5.3 马泰勒虫病的ELISA 诊断方法的建立  56-60
    5.3.1 阴性血清的制备  56-57
    5.3.2 阳性血清的制备  57
    5.3.3 重组抗原的纯化  57-58
    5.3.4 马泰勒虫EMA1 基因的重组抗原的间接ELISA 试验  58-60
  5.4 结果  60-65
    5.4.1 马泰勒虫 EMA1 基因的扩增  60
    5.4.2 系统发育进化分析  60-61
    5.4.3 基因表达产物的SDS-PAGE  61-62
    5.4.4 EMA1 重组蛋白的纯化及SDS-PAGE 结果  62-63
    5.4.5 表达产物的Western-blotting  63
    5.4.6 ELISA 最佳条件选择  63-65
  5.5 讨论  65-67
第六章全文结论  67-69
附录  69-71
致谢  71-72
作者简介  72-73
参考文献  73-77

马泰勒虫分类学定位佐证及PCR、ELISA检测方法的建立

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