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BVDV NS3表位串联及抗体间接ELISA方法的建立

作　者: 贾莹
导　师: 王君伟
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛病毒性腹泻酶联免疫吸附试验非结构蛋白表位串联临床应用
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 67次
引　用: 2次
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内容摘要

牛病毒性腹泻病(BVD),是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的一种疾病,在全世界广泛分布。其临床症状主要表现为腹泻,急、慢性黏膜病,持续性感染与免疫耐受、免疫抑制,母畜流产、死胎和畸胎等。由于其能引起繁殖系统病变并能形成持续感染,因而该病的流行给世界养牛业造成了巨大的经济损失。目前世界各国控制和消除BVDV的主要措施是持续性感染动物的检测和淘汰,因此建立一种有效的抗体检测方法,结合有效的抗原检测手段净化持续性感染牛只,对消除和控制BVDV感染具有重要的意义。BVDV的非结构蛋白NS3在瘟病毒属中非常保守,是一种免疫优势蛋白,在自然感染或者弱毒活疫苗免疫后的动物体内均可检出针对该蛋白的抗体。本研究选择本实验室筛选出的NS3蛋白的2个B细胞线性表位肽的编码核酸序列进行优化后,将其克隆到pET-30a载体上,中间间隔柔性氨基酸(G4S)2,利用同尾酶特性将2个表位反复串联,将得到的能够重复表达表位肽的目的序列以BglⅡ和XhoⅠ切下,连接到BamHⅠ和XhoⅠ双切的pET-30a载体上,构建表位基因读码框正确的重组表达载体。重组表达载体在原核表达系统中进行表达,用优选出的重组蛋白作为检测抗原建立BVDV抗体的间接ELISA检测方法,并对该方法的特异性、稳定性以及与商品化试剂盒检测结果的符合率进行探索。实验结果表明,本研究成功构建了7个能够编码不同数量表位的重组表达载体,重组蛋白在原核系统中得到了表达,经western blot鉴定,这些重组蛋白均具有良好的抗原性。根据抗原性选择了能够表达12个表位的重组蛋白r-BVDV-EX6N作为包被抗原建立抗体间接ELISA检测方法。最终建立的ELISA程序为:将纯化后的r-BVDV-EX6N蛋白0.01M NaOH包被液稀释至2μg/mL,包被到酶标板上,100μL/孔,置于4℃过夜(14h~16h);用PBST洗涤4次,每孔300μL;加入封闭液0.5%PVA+1%明胶,300μL每孔,37℃封闭2h;洗涤同前,加入被检血清1:20稀释,100μL/孔,37℃作用1h;洗涤同前,加入1:8 000稀释的酶标抗体,100μL/孔,37℃作用1h;洗涤同以前,加入TMB底物液,每孔100μL,显色15min后,加入1mol/L H2SO4(50μL/孔)终止反应,于450nm波长的酶标仪中测定OD450nm值,求出P/N值并判定结果。对该方法的特异性、稳定性以及与商品化试剂盒检测结果的符合率的研究表明,该方法可以用于BVDV抗体检测,为BVDV的防治工作提供了一种有效的辅助手段。为了解黑龙江省内BVDV的感染情况,用本实验建立的BVDV NS3表位串联蛋白抗体间接ELISA检测方法对黑龙江省内不同地区的4个奶牛养殖场的血清样本进行BVDV抗体检测。结果显示4个奶牛养殖场BVDV血清阳性率分别为41%、21%、17%、27%,表明在黑龙江省奶牛养殖场中牛病毒性腹泻病毒感染率较高。

全文目录

摘要  8-9
英文摘要  9-11
1. 引言  11-22
  1.1 病毒的生物学特性  11-12
    1.1.1 形态特征  11
    1.1.2 BVDV 分型  11-12
  1.2 BVDV 基因组结构及其功能  12-15
    1.2.1 BVDV 非翻译区  12-13
    1.2.2 BVDV 结构蛋白  13-14
    1.2.3 BVDV 非结构蛋白  14-15
  1.3 牛病毒性腹泻/黏膜病的类型  15-16
    1.3.1 急性感染  15
    1.3.2 先天性感染  15
    1.3.3 持续型感染  15-16
    1.3.4 黏膜病  16
  1.4 牛病毒性腹泻/黏膜病的流行状况  16-18
  1.5 诊断方法  18-20
    1.5.1 抗原诊断方法  18-19
    1.5.2 牛病毒性腹泻病血清学检测方法  19-20
  1.6 BVDV 清除计划  20-21
  1.7 本实验的目的与意义  21-22
2. 材料与方法  22-30
  2.1 材料  22-23
    2.1.1 质粒、菌株和血清  22
    2.1.2 主要试剂  22
    2.1.3 主要仪器  22-23
  2.2 实验方法  23-30
    2.2.1 表位的选择及引物的设计  23
    2.2.2 重组表达载体的构建  23-26
    2.2.3 nN 蛋白的原核表达和鉴定  26-27
    2.2.4 牛 BVDV 抗体间接 ELISA 检测方法的标准化  27-28
    2.2.5 特异性试验  28
    2.2.6 重复性试验  28-29
    2.2.7 与同类商品化试剂盒的对比  29
    2.2.8 BVDV NS3 表位串联蛋白抗体间接 ELISA 方法的初步应用  29-30
3. 结果与分析  30-39
  3.1 表位串联重组载体的构建  30-32
  3.2 串联蛋白的诱导表达和抗原性鉴定  32-33
    3.2.1 串联蛋白的诱导表达  32-33
    3.2.2 串联蛋白的western blot 鉴定  33
  3.3 重组蛋白 EX6N 的可溶性分析与纯化  33-34
  3.4 牛 BVDV 抗体间接 ELISA 方法的建立及标准化  34-36
    3.4.1 抗原和被检血清最佳稀释度的测定  34
    3.4.2 包被液的选择  34
    3.4.3 最佳封闭液的选择  34
    3.4.4 最佳酶标抗体工作浓度的选择  34-35
    3.4.5 最佳被检血清和酶标抗体作用时间的选择  35-36
    3.4.6 最佳显色时间的确定  36
  3.5 BVDV 间接 ELISA 临界值的确定及阳性结果的判定  36-37
  3.6 BVDV 抗体间接 ELISA 特异性检测  37
  3.7 BVDV 抗体间接 ELISA 重复性试验  37
  3.8 BVDV 抗体间接 ELISA 与同类商品化试剂盒的对比  37-38
  3.9 BVDV 抗体间接 ELISA 方法初步应用  38-39
4. 讨论  39-42
  4.1 串联技术的优点  39
  4.2 检测抗原的选择  39-40
  4.3 表达形式的优化及纯化  40
  4.4 ELISA 条件的选择  40-42
5. 结论  42-43
致谢  43-44
参考文献  44-48
攻读硕士学位期间发表的学术论文  48

BVDV NS3表位串联及抗体间接ELISA方法的建立

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