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抗Asia1型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及其金标试纸条的研制

作　者: 林彤
导　师: ?蒈?李克生；薛慧文
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: Asia1型口蹄疫病毒 杂交瘤技术 单克隆抗体 试纸条
分类号: S854.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


利用杂交瘤细胞技术，以表达的Asial型口蹄疫病毒VP1蛋白免疫BALB／c小鼠，无菌条件下取小鼠脾细胞与SP2／0细胞进行细胞融合。经多次克隆和间接ELISA筛选，获得三株能分泌抗Asial型口蹄疫的单克隆杂交瘤细胞株，并对其特性作了鉴定。在此基础上，利用胶体金免疫层析技术制备了Asial型口蹄疫病毒单抗胶体金诊断试纸条。经单克隆抗体亚类鉴定，三株单克隆抗体依次为IgG1、IgG2a和IgG2b。杂交瘤细胞株的染色体计数为104条，在杂交瘤细胞染色体范围内。用间接ELISA对腹水和细胞上清液中单抗效价进行测定，三株单抗的腹水中单抗效价≥1∶106，而细胞上清中单抗效价≥1∶104。用叠加实验对3株单抗的抗原位点进行了分析，发现三株单抗针对2个不同的抗原位点，其中2株单抗作用于同一抗原表位。对所获得的三株单抗经SDS-PAGE电泳，结果显示，所有单抗重链的分子量均为45kD左右，轻链的分子量为25kD左右。三株杂交瘤细胞和注射小鼠腹腔内的杂交瘤细胞经过5次连续传代后，用间接ELISA对每代次的细胞上清中的单抗效价进行了检测，传代细胞每代的单抗效价稳定在1∶104左右，腹水的抗体效价稳定于1∶105～106。用Asial单抗分别与O、A、C、Asial型病毒抗原和Asial重组抗原进行反应，结果三株单抗均与Asial型口蹄疫病毒和表达VP1蛋白有特异的反应，而与C、O和A型口蹄疫抗原不发生交叉反应。利用获得的单抗成功研制出了检测Asial型口蹄疫病毒抗原的金标快速诊断试纸条。用该试纸条分别对A、O、C和Asial型口蹄疫病毒抗原以及猪水泡病病毒抗原等87份田间样品进行了检测，发现检测Asial型口蹄疫病毒抗原的试纸条出现2条明显的条带，而A、O、C型口蹄疫病毒抗原以及猪水泡病病毒抗原只出现对照线，检测线没有条带，说明该试纸条不口蹄疫病毒A、O、C型以及猪水泡病病毒抗原发生反应，特异性强。用该试纸条对口蹄疫细胞毒液(10-7TCID50)的10倍系列稀释液进行了检测，最低可以检测到大约10-4TCID50。初步实验确定该试纸条在4℃、37℃和室温下的有效期为4个月。对于Asial型口蹄疫病毒金标试纸条的特性和应用Asial型口蹄疫病毒单克隆抗体的诊断价值还有待进一步的研究。

全文目录


摘要  2-3
Summary  3-7
第一篇 文献综述  7-17
  一、抗体研究进展  8-11
    1 单克隆抗体  8-9
    2 基因工程抗体  9-11
      2.1 嵌合抗体  9
      2.2 单链抗体  9-10
      2.3 抗独特型单克隆抗体  10
      2.4 抗体酶  10-11
      2.5 噬菌体抗体库技术  11
      2.6 功能性小分子抗体片断  11
      2.7 核糖体展示  11
  二、免疫途径的改进  11-13
    1. DNA免疫  11-12
    2. 细胞免疫  12
    3. 多位点重复免疫  12-13
  三、口蹄疫诊断技术  13-17
    1. 微量补体结合试验  14
    2、间接夹心ELISA  14
    3、反向间接血凝试验  14
    4、液相阻断-ELISA  14-15
    5、原位杂交  15
    6、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)  15
    7、多重RT-PCR  15-16
    8. 酶联免疫吸附试验  16-17
第二篇 研究报告  17-38
  一、材料  17-19
    1 抗原、细胞株、动物  17
    2 主要试剂  17-18
      2.1 细胞培养用试剂  18
      2.2 免疫学试剂  18
      2.3 其他生化试剂  18
    3 主要仪器设备  18-19
  二、方法  19-27
    1 动物免疫，筛选方法的建立及小鼠效价测定  19-20
      1.1 动物免疫  19
      1.2 筛选方法的建立  19-20
      1.3 小鼠效价的测定  20
    2. 杂交瘤细胞株的建立  20-22
      2.1 骨髓瘤细胞的准备  20
      2.2 饲养细胞的准备  20-21
      2.3 脾细胞的准备  21
      2.4 细胞的融合  21-22
      2.5 杂交瘤细胞的筛选  22
      2.6 杂交瘤细胞的克隆化培养  22
    3. 杂交瘤细胞的扩大培养及冻存  22-23
      3.1 杂交瘤细胞的扩大培养  22
      3.2 杂交瘤细胞的冻存  22-23
    4. 单克隆抗体的大量制备  23
    5. 单克隆抗体的纯化  23-24
      5.1 饱和硫酸铵沉淀法  23
      5.2 Sephacryl S-300 HR层析法  23-24
    6. 单克隆抗体的鉴定  24-27
      6.1 细胞培养上清和腹水效价测定  24
      6.2 抗体亚类鉴定  24
      6.3 杂交瘤细胞的染色体鉴定  24-25
        杂交瘤细胞染色体计数步骤按照以下进行  24-25
      6.4 单克隆抗体的稳定性鉴定  25
      6.5 细胞体外传代试验  25
      6.6 连续冻存复苏试验  25
      6.7 腹水连续传代试验  25-26
      6.8 单克隆抗体的特异性  26
      6.9 单克隆抗体的位点分析  26
      6.10 单克隆抗体的SDS-PAGE电泳  26-27
  三、结果  27-34
    1 纯化抗原的蛋白含量测定  27-28
    2 ELISA最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度的确定  28
    3. 全部免疫小鼠抗体效价的检测  28-29
    4 杂交瘤细胞株的建立  29
    5 细胞培养液上清和腹水效价测定  29
    6 单克隆抗体纯化结果  29-30
    7 单克隆抗体的初步鉴定  30-34
      7.1 抗体亚类鉴定  30-31
      7.2 杂交瘤细胞的染色体计数结果  31
      7.3 杂交瘤细胞稳定性的鉴定  31-33
      7.4 单克隆抗体的特异性  33
      7.5 单克隆抗体的位点分析  33-34
      7.6 单克隆抗体的SDS-PAGE电泳  34
  四、讨论  34-37
    1 抗原的制备  34-35
    2 动物免疫  35
    3 细胞融合过程中应注意的几个问题  35
    4 杂交瘤细胞株的筛选  35-36
    5 腹水的制备  36
    6 单克隆抗体的纯化  36-37
  五、小结  37-38
第三篇 单抗的应用  38-49
  一、材料  38-39
    1、主要仪器  38
    2、溶液  38
    3、试剂和材料:  38-39
  二、方法  39-42
    1 纯化后单克隆抗体效价和蛋白浓度的测定  39
    2. 胶体金制备  39-40
      2.1 金标记抗体稳定点的调定  39-40
      2.2 金标记抗体制备  40
    3. 测试条的制备和初步试验  40-42
      3.1 反应膜制备  40
      3.2 测试条的组装和切割  40-42
    4. 测试条的初步试验  42
    5. 金标试纸条的特异性试验  42
    6. 金标试纸条的敏感性试验  42
    7 金标试纸条的稳定性试验  42
    8. 金标试纸条的田间试验  42
  三、结果  42-46
    1 单克隆抗体的纯化后效价测定  42-43
    2 胶体金的制备  43
    3 测试条的初步试验结果  43-44
    4. 金标试纸条特异性试验结果  44
    5 金标试纸条敏感性试验结果  44-45
    7. Asia1型口蹄疫金标试纸条的完整形式  45
    8. Asia1型口蹄疫金标试纸条田间试验  45-46
  四、讨论  46-48
    1 关于柠檬酸三钠还原法  46
    2 制备胶体金及金标记抗体的注意事项  46-47
    3 测试条的制备和试验  47-48
  五、小结  48-49
结论  49-50
致谢  50-51
参考文献  51-58
附录1 溶液的配制  58-64
  一、细胞培养及筛选用溶液的配制  58-59
  二、酶联免疫吸附试验(ELISA)使用试剂的配制  59
  三、电泳使用试剂的配制  59-60
  四、染色体核型分析用试剂的配制  60-64
作者简介  64-65
导师简介  65-66

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医临床医学 > 兽医诊断学 > 实验室诊断法
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