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牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3 B细胞线性表位的鉴定

作　者: 李岩
导　师: 王君伟
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛病毒性腹泻黏膜病感染 B细胞线性表位非结构蛋白进化树差异性分析
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus)隶属于黄病毒科(Flaviridae)、瘟病毒属(Pestivirus)。该病毒可以造成牛只的持续性感染,并且不表现出显著的症状,也可引发牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea, BVD),临床表现为白细胞减少、黏膜糜烂溃疡、腹泻及怀孕母牛流产或产出畸形胎。该病的流行已经给世界养牛业造成了巨大的经济损失。NS3蛋白具有较高的免疫原性,在病毒感染过程中,免疫系统的CD4~+ T细胞主要识别NS3和E2两种蛋白,并可诱导免疫细胞产生针对该蛋白的抗体。因此检测NS3蛋白抗体水平可以作为检测牛病毒性腹泻病毒感染的有效指标之一。本研究利用大肠杆菌表达系统分段表达重组NS3蛋白,利用标准阳性血清筛选NS3蛋白B细胞线性表位区,共筛选出6段具有反应原性的蛋白肽段;(1VCKKITEHERCHVNI15),(20AFFGVMPRGTTPRAPVR36),(46RRGLETGWAYTHQGGI61),(281EGDMATGITYASYGYFC297),(426YSGEDPANLRVVTSQSPYVVVATNAIESGV455)和(481FIVTGLKRMAVTVGEQA497)。筛选出的表位不但可以作为BVDV的检测抗原建立多种检测血清学检测手段,亦为今后开展非结构蛋白NS3的抗原结构甚至致病机理的研究提供理论依据。同时本研究应用套式RT-PCR方法扩增出牛病毒性腹泻病毒VEDEVAC株编码NS3蛋白的基因,克隆至表达载体pET-30a(+),并进行测序。对瘟病毒属病毒NS3基因进行氨基酸差异性分析显示平均P-distance为0.07,基于NS3的系统进化树分析表明VEDEVAC株隶属于BVDV 1型。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-10
1 引言  10-18
  1.1 病毒的特性  10-12
    1.1.1 病毒的分类地位  10-11
    1.1.2 病毒的理化特征  11-12
    1.1.3 病毒的生物型  12
  1.2 BVDV 的基因组及其功能  12-15
    1.2.1 BVDV 的结构蛋白  12-13
    1.2.2 BVDV 的非结构蛋白  13-14
    1.2.3 BVDV 的非编码结构  14-15
  1.3 BVDV 的临床特征  15-16
    1.3.1 急性临床症状及粘膜病  15
    1.3.2 持续性感染  15-16
    1.3.3 自然感染与自愈  16
  1.4 BVDV 的预防及检测  16-17
    1.4.1 BVDV 的疫苗  16
    1.4.2 BVDV 的检测  16-17
  1.5 本研究的目的及意义  17-18
2 材料与方法  18-30
  2.1 材料  18-21
    2.1.1 病毒与细胞  18
    2.1.2 质粒与菌株  18
    2.1.3 实验用血清  18
    2.1.4 常用生物学试剂  18
    2.1.5 主要仪器  18-19
    2.1.6 引物  19
    2.1.7 Oligo 片段合成  19
    2.1.8 生物信息学分析软件  19-21
  2.2 实验方法  21-30
    2.2.1 NS3 基因的RT-PCR 扩增与表达载体的构建  21-23
    2.2.2 瘟病毒属基因差异性分析及基于BVDV NS3 基因的进化树的构建  23
    2.2.3 NS3 基因片段的RT-PCR/PCR 扩增与表达载体的构建  23-25
    2.2.4 NS3 基因片段的人工合成及表达载体构建  25-26
    2.2.5 蛋白的原核表达和鉴定  26-27
    2.2.6 原核表达蛋白的切胶纯化  27
    2.2.7 原核表达蛋白的亲和层析纯化  27-28
    2.2.8 蛋白纯化产物的western-blot 验证  28-29
    2.2.9 蛋白纯化产物的western-blot 分析  29
    2.2.10 目标蛋白的ELISA 分析  29-30
3 结果与分析  30-38
  3.1 pET-30a(+)-NS3 重组质粒的鉴定  30
  3.2 分段表达载体的测序结果  30
  3.3 pET-30a(+)-NS3 重组质粒表达及纯化结果  30-31
  3.4 瘟病毒属基因差异性分析  31
  3.5 进化树的构建  31-32
  3.6 分段蛋白纯化表达结果  32-33
  3.7 表达纯化蛋白的western-blot 鉴定  33-34
  3.8 表达纯化蛋白的western-blot 分析  34-36
  3.9 目标蛋白的ELISA 分析  36
  3.10 目标蛋白序列与瘟病毒属病毒序列的比对分析结果  36-38
4 讨论  38-41
  4.1 NS3 全长蛋白的原核表达  38
  4.2 NS3 蛋白的关键地位  38
  4.3 基于NS3 核酸序列的进化树的构建  38
  4.4 普通片段克隆策略  38-39
  4.5 小于 60bp 片段的克隆策略  39
  4.6 蛋白纯化方案的选择  39
  4.7 表位的筛选  39
  4.8 表位的预测  39-40
  4.9 选择NS3 作为线性表位筛选对象的依据  40-41
5 结论  41-42
致谢  42-43
参考文献  43-47
附件1  47-52
攻读硕士学位期间发表的学术论文  52

牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3 B细胞线性表位的鉴定

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