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sytI分子特性分析与miRNA对丝蛋白调控

作　者: 曹军
导　师: 金勇丰
学　校: 浙江大学
专　业: 遗传学
关键词: RNA编辑纯化选择 GC含量 △G Ka/Ks microRNA 家蚕靶点鉴定瞬时表达
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

Synaptotagmins（syt）是膜转运蛋白中的一个家族,它广泛存在与生物神经系统中,它含有两个钙结合区:C2A和C2B,通过调控Ca²⁺内流以诱导突触囊泡发生胞吐而引起神经递质释放。本文就sytⅠ的分子特性如影响RNA编辑的发生、C2结构域的组织特征等做一阐述。RNA编辑是生物体调节生物功能的一个重要机制。我们意外发现果蝇sytⅠ转录本中发生编辑的外显子具有较低的GC、GC3含量及较高的Gibbs自由能,系统分析果蝇的其它47个已实验验证的编辑外显子发现这种趋势同样存在。序列比队、Ks和Ka/Ks分析结果显示编辑的外显子经受了更大的纯化选择,这种选择压力可以抑制核苷改变,这与进化中相同特性的外显子所经受的潜在核苷置换率相矛盾。编辑外显子的这种特异分子特性或组成（如较低的GC含量）等很可能是除双链RNA（dsRNA）外另一个指引RNA编辑发生的必备条件。这样,DNA分子特性、RNA编辑和纯化选择三者之间可能会存在某种联系。通过突变sytⅠ外显子GC含量等实验进一步证明DNA分子特性的改变如GC含量的增加或降低可以明显地影响编辑位点的编辑效率,这或许与分子活跃性有关。sytⅠ的另一个分子特性是它含有保守的C2结构域,为了进一步研究其在生物进化中的作用,我们分别在拟南芥、线虫、果蝇和人类基因组鉴定了104,44,44和142个基因,它们分别含有154,65,63和218个C2结构域。系统发生分析表明这些基因大致可分为28个组,但是动物和植物C2结构域间并没有发现相似性,这可能说明了C2结构域在这两个真核种系的独立起源。同一进化分枝内外显子/内含子组织结构的保守性进一步支持了它们之间进化的相互关系。内含子相的非均匀性分布表明这些C2结构域在进化过程中受到特定的选择。我们发现内含子丢失不仅发生在编码序列的3’端,而且也发生在其它区域,这可能与不同的内含子丢失机制相关。microRNA是一类小分子非编码性RNA,它在基因表达调控中发挥重要角色。尽管国际贸易中丝绸是最重要的织品及原料之一,但是关于家蚕miRNA及其靶点鉴定方面的研究报道甚少。本文中,我们从家蚕基因组中鉴定了41个miRNA,它们分属于37个家族,并且我们对随机抽取的25个miRNA做表达分析,结果证实其可靠性。另外还描述了家蚕miRNA的一些特性,如位置特异性核苷分布、进化保守性与串联组织分布等等。另外我们又在家蚕基因组中鉴定了129个miRNA潜在靶位点。GO分子功能分析表明这些靶基因绝大部分具有结合、酶、转录调节等活性,这可能于miRNA参与各种重要的生物过程如发育、细胞增殖、分化、细胞凋亡、代谢调节等有关。我们也发现至少有四种miRNA（miR-33/-190/-276/-7）潜在结合到蚕丝蛋白的3’UTR区,这或许表明miRNA在蚕丝发育中扮演重要角色。接下来我们克隆了家蚕丝蛋白3’UTR区,并且对其中的两个miRNA结合位点进行了突变,把它们连接到报告基因GUS后面构建了四种表达载体。对相应的miRNA我们也构建了不同的表达载体。通过农杆菌渗透实验共表达分析,GUS染色、RT-PCR、GUS酶活测定结果表明所预测的miRNA（33-miR/7-miR）均能调控蚕丝蛋白基因的表达,并且这种调控是以miRNA与靶位点互补性结合为基础的。研究还发现人工合成的miRNA同样也能起到调控靶基因表达的目的。另外,与通常所用的细胞转化或稳定转基因相比,叶片瞬时表达体系是一种高效简便的方法,它可以广泛应用与各种动植物miRNA调控研究中。

全文目录

中文摘要  6-8
英文摘要  8-11
第一章文献综述  11-32
  1.1 RNA编辑研究进展  11-22
    1.1.1 参与编辑的常见酶类及种类  11-12
    1.1.2 常见的编辑类型  12-14
      1.1.2.1 A到I的RNA编辑  12-13
      1.1.2.2 C到U的RNA编辑  13-14
    1.1.3 影响编辑的因素  14-18
      1.1.3.1 编辑位点5'-序列的影响  14
      1.1.3.2 编辑位点3'-序列的影响  14
      1.1.3.3 编辑位置5'端邻近核苷的影响  14-15
      1.1.3.4 距离的影响  15
      1.1.3.5 引导RNA(gRNA)的影响  15
      1.1.3.6 密码子偏爱性的影响  15-16
      1.1.3.7 ATP的影响  16
      1.1.3.8 编辑位点间非独立性(共编辑)的影响  16
      1.1.3.9 编辑位点互补序列(ECS)的影响  16-17
      1.1.3.10 进化保守性及选择性压力的影响  17
      1.1.3.11 基因组重复序列的影响  17-18
    1.1.4 鉴定RNA编辑的方法  18-19
      1.1.4.1 随机鉴定法  18
      1.1.4.2 序列保守性比较法  18
      1.1.4.3 基因组序列与cDNA序列对比法  18-19
      1.1.4.4 免疫亲和纯化法  19
    1.1.5 RNA编辑与疾病  19-20
    1.1.6 RNA编辑与microRNA/RNAi的关系  20-21
    1.1.7 RNA编辑的进化意义  21-22
  1.2 miRNA研究进展  22-32
    1.2.1 发现历史  22-23
    1.2.2 miRNA的生物合成  23-24
    1.2.3 miRNA基因组结构与表达调控  24
    1.2.4 常见的miRNA数据资源  24-25
    1.2.5 miRNA预测方法  25-26
    1.2.6 常见的候选miRNA实验鉴定方法  26-27
      1.2.6.1 Northern杂交  26
      1.2.6.2 克隆与RT-PCR方法  26-27
      1.2.6.3 原位杂交  27
      1.2.6.4 芯片技术  27
    1.2.7 miRNA与动、植物发育  27-29
    1.2.8 miRNA与疾病  29-30
    1.2.9 miRNA与生物进化  30
    1.2.10 miRNA的另一面——启动性  30-32
第二章 syt I分子特性对RNA编辑的调控  32-51
  2.1 引言  32-33
  2.2 材料与方法  33-39
    2.2.1 所用数据库及计算软件  33
    2.2.2 基因组DNA提取  33-34
    2.2.3 总RNA提取  34
    2.2.4 反转录第一条cDNA链合成  34-35
    2.2.5 RT-PCR扩增  35-36
    2.2.6 PCR产物胶回收  36
    2.2.7 PCR扩增产物的T载体连接反应  36-37
    2.2.8 E.coli TG1感受态细胞的制备  37
    2.2.9 连接产物转化感受态细胞  37
    2.2.10 质粒DNA提取  37-38
    2.2.11 利用Lipofectamine 2000(invitrogen)转染家蚕BmN细胞  38-39
  2.3 结果与讨论  39-51
    2.3.1 昆虫syt I转录本中编辑外显子和非编辑外显子具有不同的GC、GC3含量及平均ΔG  39-41
    2.3.2 编辑外显子具有较低的GC3和GC含量及较高的ΔG在果蝇基因组中是一种普遍的趋势  41
    2.3.3 进化过程中具有较低GC3、GC含量和较高ΔG的编辑外显子并没有呈现其应有的高取代率  41-42
    2.3.4 编辑外显子中较高的纯化选择抑制了核苷改变  42-44
    2.3.5 纯化选择、RNA编辑及DNA分子特性三者之间的关系  44-45
    2.3.6 果蝇syt I编辑外显子突变载体构建分析  45-46
    2.3.7 利用家蚕BmN细胞共转染方法鉴定果蝇syt I外显子GC含量对其编辑效率的影响  46-47
    2.3.8 果蝇syt I编辑外显子GC含量可影响其上编辑位点的编辑效率  47-49
    2.3.9 GC含量是否同样会影响其它昆虫物种特异性syt I转录本的编辑效率?  49-51
第三章 syt I保守结构域C2组织结构分析  51-63
  3.1 引言  51
  3.2 材料与方法  51-52
  3.3 实验结果  52-60
    3.3.1 拟南芥、线虫、果蝇和人类C2结构域基因的鉴定  52-53
    3.3.2 拟南芥、线虫、果蝇和人类C2结构域的特点  53-54
    3.3.3 C2结构域拼接一致序列的保守性与进化  54-56
    3.3.4 C2结构域基因结构及其功能进化保守性  56-57
    3.3.5 C2结构域的系统发生学分析  57-59
    3.3.6 C2结构域不同类型的内含子丢失现象  59-60
  3.4 讨论  60-63
    3.4.1 内含子相分布与进化  61
    3.4.2 拼接序列一致性与进化  61-62
    3.4.3 C2结构域组织结构的进化保守性  62-63
第四章家蚕miRNA及其靶点鉴定  63-77
  4.1 引言  63-64
  4.2 材料与方法  64-66
    4.2.1 数据库及miRNA预测  64
    4.2.2 RNA提取、多聚腺苷化及cDNA合成  64-65
    4.2.3 miRNA表达分析  65
    4.2.4 miRNA靶点预测  65-66
    4.2.5 miRNA-mRNA二级结构标准和靶基因的GO分析  66
  4.3 结果与讨论  66-76
    4.3.1 家蚕miRNA鉴定及特性  66-71
    4.3.2 家蚕miRNA的表达分析  71-72
    4.3.3 家蚕miRNA靶点鉴定  72-76
  4.4 结论  76-77
第五章异源体系鉴定miRNA对蚕丝蛋白的调控  77-85
  5.1 引言  77-78
  5.2 材料与方法  78-81
    5.2.1 植物材料与生长环境  78
    5.2.2 RNA提取与RT-PCR  78-79
    5.2.3 miRNA/靶点杂交及其二级结构预测  79
    5.2.4 载体构建  79-80
    5.2.5 农杆菌培养与叶片渗透  80
    5.2.6 GUS组织化学染色与酶活分析  80-81
  5.3 结果与讨论  81-85
    5.3.1 家蚕丝蛋白3'UTR序列克隆与表达载体构建  81-82
    5.3.2 内源miRNA抑制靶基因的表达  82-83
    5.3.3 miRNA与靶位点的序列互补是其调控基因表达的首要条件  83-84
    5.3.4 叶片瞬时表达可以作为一种鉴定miRNA靶点调控的高效方法  84-85
参考文献  85-99
附件-A  99-101
附件-B  101-102
附件-C  102-107
附件-D  107-108
附件-E  108-113
附件-F  113-117
附件-G  117-120
博士阶段发表论文列表  120-121
致谢  121

sytI分子特性分析与miRNA对丝蛋白调控

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