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跨膜TACE活性原位测定及膜脂微环境对TACE活性的调节

作　者: 冯文芳
导　师: 杨渝珍
学　校: 华中科技大学
专　业: 生物化学与分子生物
关键词: 肿瘤坏死因子α转化酶 酶活性 高效液相色谱 模拟底物肽 米氏常数 黄连素 甲基环糊精 胆固醇 膜流动性 肿瘤坏死因子转换酶
分类号: R341
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


第一部分底物肽-HPLC原位测定跨膜TACE活性方法的建立【背景】肿瘤坏死因子α转换酶（Tumor necrosis factor-alpha converting enzyme,TACE,也即ADAM17）是将膜型肿瘤坏死因子α（mTNF-α）转换为可溶性肿瘤坏死因子α（sTNF-α）的主要分泌酶,同时也介导许多其它细胞因子及细胞因子受体的加工脱落,在炎症反应、免疫应答、增殖分化调节以及肿瘤的发生发展等众多生理病理过程中发挥着重要的作用。但TACE如何特异性识别底物分子,如何进行活性调节和控制等,都是研究者们一直感兴趣却又没能彻底解决的问题。回答这些问题首先需要一种快速、准确且重复性好的酶活性检测方法,来实时观测研究过程中的酶活性改变。常用的测定酶活性的方法主要有两类:一是以检测酶-底物反应产物为基础的方法,如底物肽-HPLC法、底物胶电泳法、MTT细胞毒实验等,另一类是以检测酶表达量为基础的辅助方法,如酶联免疫吸附（ELISAs）、Western Blot、流式细胞术（FACS）、间接免疫荧光等。前者主要应用在酶活性调节研究上,如酶活性调节机制、酶抑制剂药物等,后者则主要辅助探索酶活性改变的影响机制。底物肽-HPLC法是将人工模拟底物肽与高效液相色谱技术（HPLC）结合起来的一种快速准确且适合高通量筛选的酶活性检测方法。即根据底物分子中被酶特异性识别和水解的特定序列,人工合成具有底物功能的寡肽,能够被酶的活性中心识别、结合和特异性水解,且不易被其它蛋白酶降解。建立酶与底物模拟肽的催化水解反应体系,并利用HPLC定量分析反应产物的变化,从而评价酶对特定底物的专一性和催化活性。如果用紫外或荧光基团标记底物肽分子,可以将检测限降至纳克级,提高检测灵敏度。此方法直接监测酶催化水解底物的产率变化,是最直观最有力地评价酶活性的指标。目前底物肽-HPLC法以其快速准确,重复性好,灵敏度高,适合高通量药物筛选研究等优势,在酶活性研究中得到广泛的应用。【目的】1.建立检测TACE活性的TNFα模拟底物肽-HPLC方法,并通过与底物胶电泳、MTT细胞毒法、FACS等方法的比较,对该技术进行评估;2.应用所建立的底物肽-HPLC方法研究人重组TACE（rhTACE）对底物肽的酶促反应动力学,通过Km,Vmax,kcat/Km等动力学常数的测定,评价rhTACE的底物专一性和催化活性,并通过与文献数据对比验证方法的可行性。3.应用所建立方法进行活细胞膜TACE活性研究。【方法】1.模拟TACE底物TNFα水解位点附近的氨基酸序列,合成高纯度（95%）带紫外标记的底物肽段Dnp-SPLAQAVRSSSR-NH2;2.优化适合分离底物肽及TACE水解后的裂解小肽的色谱操作条件,包括紫外吸收波长、梯度洗脱条件、流动相流速、进样量等色谱参数的优化和选择。3.优化TACE-底物肽反应体系,包括反应缓冲体系的选择,最适pH值,温度的影响,反应终止条件等。4.TACE-底物肽酶促动力学研究。包括确定反应初始速度阶段所需的酶量,在一定酶量下不同底物肽浓度与反应初速度之间的关系,并根据米氏方程利用Lineweaver-Burk双倒数作图法求出动力学常数Km,Vmax,kcat/Km。5.建立U937,HEK293细胞与底物肽的微升级反应体系,HPLC法观测细胞数量改变（即酶浓度的改变）对一定浓度底物肽水解反应的影响,以及细胞酶激活剂与抑制剂对酶活性的影响。6.多方法对比评估:底物明胶电泳法测定金属蛋白酶（MMP）,rhTACE对底物明胶的水解活性;MMT法观察受PMA和LPS刺激的细胞上清中的可溶性TNFα（sTNFα）对L929的细胞毒性:FACS法检测LPS刺激后细胞膜上TACE分子的表达量的改变。对以上各方法的灵敏度,适用范围作出评价。【结果】1.确定了TACE-peptide体系的反相色谱分析条件（M5）:[1]C8反相色谱柱（4.6mm×50mm）;[2]检测波长为350nm;[3]流动相为A:20%乙腈+80%水,B:60%乙腈+40%水,含1%TFA;[4]梯度洗脱条件为100%A平衡5min,随后在20min内将100%A线性递变为100%B;[5]流动相流速为0.8mL/min;进样量为10～15μl。2.确定了TACE-底物肽反应缓冲体系的组成:25 mM Tris-HCl（pH 8.5）,2.5μM ZnCl2,5%Glycerol;加入1%TFA终止酶解反应。3.确定了在反相色谱分析条件（M5）下纯肽的标准工作曲线,用来校正HPLC实测的峰面积与真实浓度的关系。4.确定了酶促反应初速度阶段所需的酶量:当底物浓度为20μM时,反应初速度阶段所需TACE的量应≤1.5 ng/μl,所以在10～80μM底物肽反应体系中,我们所加的TACE始终选择为1 ng/μl。5.测定了pH 8.5,温度分别为25℃和37℃时TACE对底物肽的酶促反应米氏常数Km为62.84μM（37℃）和37.02μM（25℃）,催化常数kcat值为1.5407 s-1（37℃）和0.5161 s-1（25℃）,专一性常数kcat/Km值为2.4×104 M-1·s-1（37℃）和1.4×104 M-1·s-1（25℃）。6.HEK293细胞株稳定表达TACE（ADAM17）及TNFα,但不表达其它基质金属蛋白酶（MMP）,可以减少反应体系中的非特异性水解,是作为底物肽-HPLC法在细胞体系应用的理想的细胞模型。在100μl的自然细胞反应体系中,20min以内几乎检测不到TACE产物峰;但使用金属蛋白酶激活剂PMA和药物（小檗碱）处理细胞后再与底物肽发生酶促反应,则可以在较短的反应时间（≤20min）内准确检测到TACE产物峰,并观察到使用金属蛋白酶抑制剂时产物峰面积减小,且都与处理时间和浓度呈线性变化关系。纯酶体系和细胞体系的产物峰,均通过HPLC-MASS联用分析得以证实。7.底物明胶电泳实验结果表明,经过LPS刺激后的U937细胞的MMP酶谱表达有明显增加,但rhTACE的用量达50ng仍未能得到阳性结果:MMT细胞毒实验结果表明,在LPS和PMA刺激下的HL-60和U937细胞产生sTNF-α的变化,发现刺激组的细胞上清对L929的杀伤率比对照组有明显提高;FACS实验结果表明,LPS刺激对膜蛋白TACE的表达量没有相应显著的变化。结果表明:底物胶电泳法不适合进行TACE活性检测:MTT法步骤繁琐,重复性差,不能严格定量分析:FACS法只能提供活性相关的辅助信息;而相比之下,底物肽-HPLC法能严格定量研究酶促反应动力学,更能对跨膜TACE实现原位活性测定。【结论】本文成功建立了底物肽-HPLC方法用来测定TACE活性,确定了TACE-底物肽体系的最佳反应条件及底物肽与TACE裂解产物肽的最佳HPLC分离条件,并测定了TACE与底物肽的反应动力学常数Km、Vmax和kcat/Km,均符合酶促反应动力学行为。在使用同类方法测定金属蛋白酶活性的文献数据中,kcat/Km值大多在104～105M-1·s-1,与我们所测定的2.4×104 M-1·s-1（37℃）和1.4×104M-1·s-1（25℃）相符,这些数据充分证实了我们所建立的底物肽-HPLC方法测定TACE活性的可行性。首次尝试将底物肽-HPLC测定TACE活性的方法应用在活细胞体系,对细胞反应体系作了优化和改良,使微升体系的活细胞膜酶TACE活性的原位检测成为可能,并得到了较理想的结果,这也是本文的重要创新点之一。首次选用HEK293细胞作为反应体系的细胞模型,并发现该模型可以有效简化裂解产物肽HPLC峰谱。酶激活剂和抑制剂对HEK293细胞膜酶TACE活性的调节可以通过HPLC图谱上底物肽产物峰的面积变化得到直观而有效的评价。本方法在细胞体系上的应用,弥补了底物明胶电泳的对底物需求量大,不能用于活细胞检测;MMT法的间接、步骤繁琐、重复性差;FACS方法只能辅助提供酶活性信息等各方法诸多无法克服的缺点,不仅能直观准确地反应酶活性,还能进行较大样本对比分析,这将对进一步探索细胞跨膜TACE活性调节机制及抑制剂的初步筛选提供重要的技术支持。第二部分细胞膜的脂质微环境对膜酶—TACE活性的调节【背景】脂筏是细胞膜脂双层结构的亚结构域。脂筏内胆固醇含量较高,比周围质膜的流动性低,其主要功能是为膜蛋白分子的组装提供了一个平台,便于它们的聚集和相互作用,并有利于蛋白质形成有效的构象。适当的胆固醇含量是维持脂筏稳定的必要因素,胆固醇含量的降低将导致细胞膜的流动性增加继而导致脂筏解体,使处在脂筏上的某些脱落酶或其底物分子的构象发生改变,相互接触并发生水解,从而触发细胞的各种生理、病理反应。为了探索在机体自然衰老过程中或在某些老年性疾病的病理过程中细胞膜微环境所发生的对应改变以及这些改变对细胞功能的影响,从而为寻找相应的对策及调节点,以延缓衰老过程这也是本课题研究的目标所在。其中,ADAM家族中的ADAM17、ADAM10、ADAM9等成员,由于对脑组织中的淀粉样前体APP具有特异的水解加工作用,因此这类与APP加工有关的α-分泌酶的活性及变化,表达及调控都是研究的热点之一。已有众多报道围绕着脂类物质含量对脂筏及细胞膜功能的影响,现已证实胆固醇含量改变对TACE的众多跨膜底物如APP（amyloid precursor protein）、CD30、L-选择素、L1黏附分子等的胞外结构域脱落有影响,提示膜胆固醇含量的变化与TACE的活性之间可能存在某种联系。使用物理性胆固醇剥夺剂甲基-β-环糊精（methyl-β-cyclodextrin,MβCD）去除细胞胆固醇不影响细胞的其它生理生化过程,是目前常用的降低质膜胆固醇含量的方法,质膜中胆固醇含量的变化可以直接导致脂筏状态的改变。利用与膜脂分子结合的荧光探剂测定细胞膜流动性改变可以评价质膜中脂筏的状态。小檗碱（berberine,BBR）是我国传统中药黄连素的主要活性成分,具有明显的降胆固醇作用。BBR最初是作为清热解毒药和抗菌药应用于临床,后来逐渐发现它具有降血糖、降血脂、抗血小板、抗老年斑、抗肿瘤等多种药理作用,而上述疾病的发生发展都与TACE对膜底物分子的脱落加工有着紧密的联系。BBR的这些药理作用对细胞膜流动性的影响,及其对细胞膜脂筏中TACE与底物分子的相互作用的调节等问题都是研究的新课题,为此,本部分将作方法学和细胞模型体系的探讨,并以TACE（ADAM17）为代表进行膜结构与功能的初步研究。【目的】1.建立基于FACS技术的细胞膜流动性检测方法。2.研究MβCD降低细胞膜胆固醇含量所带来的细胞膜流动性的改变以及TACE活性的变化,为膜流动性与TACE活性之间的因果关系提供证据。3.调查BBR对细胞膜流动性及TACE活性的影响。4.从细胞膜流动性的角度探讨BBR对细胞膜TACE活性的影响机制。【方法】1.细胞膜流动性检测方法的建立:用流式细胞仪（FACS）测定膜脂与荧光探剂MC540结合后的二维散点图和频数分布,检测脂质分子的堆积程度,进而反映膜脂流动性。2.从两方面弄清物理性剥夺细胞膜胆固醇后导致的膜流动性变化:（1）镜下观察MβCD处理HEK293和U937细胞后形态的变化;（2）用FACS法检测MβCD处理HEK293和U937细胞后膜脂质分子的堆积程度的变化。3.从两方面评价MβCD对TACE活性的影响:（1）用MTT细胞毒法研究MβCD处理HEK293和U937细胞后上清中sTNFα的变化;（2）用所建立的底物肽-HPLC方法研究MβCD处理后细胞-peptide反应体系的反应进程产率变化。4.调查不同浓度BBR处理HEK293和U937细胞不同时间后细胞膜流动性的改变,证明BBR处理与细胞膜流动性之间的联系。5.用上述方法调查TACE活性变化与BBR浓度与处理时间的关系,即用底物肽-HPLC方法研究BBR处理后细胞-peptide反应体系的反应进程产率变化;用MTT细胞毒法研究细胞上清中sTNFα的变化,并与MβCD及PMA处理组做对比,证明BBR处理与TACE活性之间的联系。6.用RT-PCR法研究BBR对HEK293和U937细胞的TACE mRNA的影响,排除调查BBR影响TACE活性的其它可能途径。【结果】1.测膜流动性方法建立:FACS检测的二维散点分布图和频数分布图均表明,当细胞膜胆固醇被MβCD物理性剥夺后,无论是悬浮U937还是贴壁HEK293细胞,均明显向高荧光强度区域扩散,且分布相对松散,这表明膜脂分子的体积增大,堆积程度更为疏松,提示细胞膜流动性的增加,结果与文献报道一致,可以确定基于FACS的细胞膜流动性检测方法的可行性。2.膜流动性实验结果:（1）经MβCD处理过的HEK293细胞,其细胞形态明显地由贴壁的梭形变为不规则的椭圆形,且形态变化趋向椭圆形与MβCD的处理量和处理时间成正比。当8mM的MβCD处理细胞1h或者16mM的MβCD处理细胞2h后,细胞膜边缘模糊,细胞贴壁不牢,有凋亡倾向。（2）用MβCD处理1h后的U937和HEK293细胞膜表面荧光强度明显增强,细胞群向高荧光区域分布更加弥散,且随着MβCD浓度的增加（0,8,16mM）,其膜表面荧光强度值也相应增加（HEK293:149,470,904;U937:177,892,2242）。U937细胞经MβCD处理后在此方面较HEK293细胞更为突出。表明MβCD处理可以增加细胞膜流动性。（3）经BBR（10～40μg/mL）处理过的U937和HEK293细胞群明显向高荧光区域分布,且弥散程度增大（HEK293:BBR 0、5、10、20、40、60、80μg/mL,荧光强度值606、687、718、1045、1165、832、730;U937:BBR 0、5、10、20、30、40gg/mL,荧光强度值175、180、218、264、262、208）。随着BBR浓度的增加,散点的分布区域逐渐扩大,提示膜流动性的增加。与MβCD处理组对比,BBR处理组增加U937和HEK293胞膜流动性不如直接降低膜胆固醇含量效果显著。结果表明:BBR处理细胞与MβCD处理结果一致,二者均对细胞产生膜流动性增加的影响。3.细胞毒实验结果:（1）4mM和8mM MβCD分别处理U937 2h后对A549细胞的杀伤率相应为11.2%和16.8%,可见随着MβCD浓度加大sTNF-α的分泌相应增加。（2）15μg/mL和30μg/mL BBR分别处理U937细胞后上清对A549的杀伤率为相应为0.5%和0.7%:100ng/mL PMA处理组的杀伤率达到19.1%;100ng/mLPMA和30μg/mL BBR同时处理U937后,杀伤率下降为7.5%;高于40μg/mL时,BBR促使A549凋亡。结果提示BBR不诱发sTNFα的分泌,同时可以抑制PMA对U937的刺激作用。sTNF-α的细胞毒实验可以间接评价其主要分泌酶TACE的活性。结果表明,BBR处理细胞并未表现出与MβCD和PMA处理的一致性,原因可能与它抑制内毒素的作用有关。同时发现当BBR的浓度大于40μg/mL,或者共孵育时间超过24h,则会促进A549细胞凋亡。4.底物肽-HPLC实验测TACE活性结果:（1）8mM和16mM的MβCD处理HEK293细胞30min后,观察活细胞膜上水解酶对TNF-α模拟肽Dnp-SPLAQAVRSSSR-NH2的水解活性。发现经MβCD处理后TACE的特异性裂解肽峰峰面积比例明显增加,且随着MβCD处理浓度（8～16mM）和酶解反应时间（5～15min）的增加,裂解肽峰面积比例也相应增加。（2）10μg/mL和20μg/ mL BBR分别处理HEK293细胞6h和24h后,将细胞与底物肽共孵育,在反应初期（5-15min）观察到TACE特异性裂解肽峰峰面积比例较未处理前增加,且有浓度时间依赖关系。裂解峰峰面积的增加说明酶促反应产率的增加,提示TACE水解活性的增强。BBR处理细胞与MβCD处理结果一致,表明二者都能增强膜酶TACE水解活性。5.RT-PCR实验中,以看家基因β-actin为参照,处理组和对照组的TACE mRNA水平在12h和24h均没有显著性差异（p＜0.05）。结果表明,不支持BBR通过增强TACE基因转录或mRNA稳定性来影响TACE活性的分子机制。【结论】本部分成功建立了基于FACS技术的细胞膜流动性检测方法。该方法对悬浮细胞和贴壁细胞均可适用。该方法与传统的DPH标记荧光偏振检测技术相比较,具有准确性更高,操作更简单,可重复定量分析等突出的优点,同时也是对FACS技术应用的一个新的尝试。本文利用该方法定性分析了细胞膜胆固醇降低所导致的质膜流动性的增加,与文献报道一致。安全无毒的传统中药黄连素小檗碱（BBR）,已有研究证明具有降胆固醇含量的药理作用,并因而可用于辅助治疗高血脂症;同时黄连素还具有显著的抑制血管平滑肌增殖、抗血小板、抗炎、抗老年斑和抗肿瘤等作用,因而在心血管和神经系统疾病方面有广泛应用前景。本文试图将黄连素的这些药理活性与膜流动性增加建立联系,并通过观察黄连素对TACE水解活性和mRNA表达水平的影响,初步探索黄连素对TACE活性影响的机制。首先证实了物理性降低膜胆固醇可以带来膜流动性的增加,也可以增加细胞膜酶的水解活性;然后证实了BBR同样有上述行为,同时并不增加TACEmRNA的表达水平。结果提示BBR增加TACE活性可能循于细胞膜流动性增加而导致的脂筏上酶分子构象变化而被激活的机制,而不支持BBR导致TACE在膜上的表达增加的分子机制。这为BBR的调脂和抗老年斑抗肿瘤活性提供了一种新的解释和研究思路,从理论上支持了抗衰老的“加强α-分泌酶活性”的指导策略,也指出了一条用中药进行调节的新途径。

全文目录


ABBREVIATIONS  6-8
摘要  8-17
Abstract  17-29
正文  29-139
  第一部分 底物肽-HPLC原位测定跨膜TACE活性方法的建立  29-88
    前言  29-32
    第一节 底物肽—HPLC测定TACE活性方法的建立  32-68
      背景介绍  32-34
      Part 1.底物肽及其水解片断的HPLC分离  34-45
        1.1 实验仪器与设备  34
        1.2 实验材料  34-35
        1.3 实验方法  35-36
        1.4 结果与讨论  36-45
        1.5 本部分小结  45
      Part 2.rhTACE纯酶—底物肽体系反应的动力学常数测定  45-56
        2.1 实验仪器与设备  45-46
        2.2 实验材料  46
        2.3 实验方法  46-48
        2.4 结果与讨论  48-56
        2.5 本部分小结  56
      Part 3.底物肽—HPLC法对活细胞原位TACE活性的测定  56-68
        3.1 实验仪器与设备  57
        3.2 实验材料  57
        3.3 实验方法  57-59
        3.4 结果与讨论  59-66
        3.5 本部分小结  66-68
    第二节 TACE活性测定的多方法对比评价  68-83
      背景介绍  68
      Part 1 生物化学方法——底物胶电泳  68-72
        1.1 主要试剂和设备  69-70
        1.2 实验方法  70-71
        1.3 结果与讨论  71-72
      Part 2 免疫学方法——MTT细胞毒法  72-76
        2.1 材料、试剂和设备  73
        2.2 实验方法  73-74
        2.3 结果与讨论  74-76
      Part 3 细胞学方法——FACS方法  76-79
        3.1 材料、试剂和设备  76-77
        3.2 实验方法  77
        3.3 结果与讨论  77-79
      Part 4 底物肽—HPLC方法的优势及其它各类方法适用性评价  79-83
        4.1 检测限和灵敏度评价  79-81
        4.2 各方法的适用范围及局限性小结  81-83
    参考文献  83-88
  第二部分 细胞膜的脂质微环境对膜酶—TACE活性的调节  88-138
    前言  88-91
    第一节 基于FACS的膜流动性测定技术  91-97
      1.1 方法原理  91-92
      1.2 材料与方法  92-93
      1.3 方法评估  93-97
    第二节 M~βCD诱导的膜流动性增强对TACE活性的影响  97-112
      2.1 M~βCD对细胞膜流动性的改变  97-102
      2.2 M~βCD对U937和HEK293细胞膜上TACE活性的影响  102-111
      2.3 本节小结  111-112
    第三节 黄连素(BBR)对细胞TACE活性的影响和机制的初步探讨  112-134
      3.1 BBR处理后HEK293及U937细胞膜流动性的改变  112-117
      3.2 BBR处理后U937细胞的sTNF-a表达量的改变  117-120
      3.3 BBR对HEK293细胞膜上TACE水解底物肽活性的影响  120-129
      3.4 BBR对HEK293和U937细胞TACE mRNA的影响  129-133
      3.5 本节小结  133-134
    参考文献  134-138
  创新点总结与展望  138-139
附录  139-140
致谢  140-141

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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