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应激过程中组织和细胞内HSPs表达与应激性损伤机理研究

作　者: 张淼
导　师: 鲍恩东
学　校: 南京农业大学
专　业: 基础兽医
关键词: 猪运输应激热休克蛋白组织损伤肉品品质凋亡
分类号: S858.28
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

随着中国养猪业集约化程度的不断提高,规模化养猪场猪的转场等所面临的中、长途运输问题越来越普遍,造成的损失也越来越明显。了解和研究运输应激损伤特征和规律以及采取合理的措施减少运输应激造成的危害具有重要意义。热休克蛋白(Heat shock proteins, HSPs)是一组高度保守的蛋白,对维持细胞生存和内环境的稳定起着十分重要的作用。本文主要通过建立运输应激模型来动态观察运输应激过程中猪组织中的HSPs的转录和表达,研究HSPs的变化规律与猪应激性损伤之间的相关性；通过原代培养大鼠心肌细胞建立体外热应激模型,探讨HSPs的组织细胞保护机制。体内试验：选取皮特兰和二花脸杂交二代仔猪20头在相同的环境条件下饲养,待体重达到50±2kg时,随机分成4组,一组作为对照组饲养在正常饲养环境中,其余三组在常规路段分别进行1h、2h和4h的运输(车速为30-40千米/小时)。运输结束后,将所有运输组和对照组猪均先注射戊巴比妥钠(10 mg/kg)后再进行剖杀。分离血清,检测血清生化指标丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)。采取心脏、肝脏、胃和背最长肌,一部分于4%多聚甲醛溶液中固定,用于组织病理学检测,另一部分则速冻并于液氮中保存,用于ELISA和荧光定量RT-PCR研究。部分背最长肌用于肉质检测。体外试验：原代培养大鼠心肌细胞72h后,将细胞分成9组(对照组和热应激10min、20 min、40 min、60 min、120 min、240 min、360 min、480 min)。按照分组给予相应的热应激后,取各组培养液用于生化指标ALT、LDH、CK、CK的同工酶(CKMB)和α-羟基丁酸脱氢酶(Hydroxybutyrate dehydrogenase, HBDH)的检测；取各组心肌细胞分别进行免疫组织化学、Western blot、荧光定量RT-PCR、流式细胞术等检测。运输后血清生化指标ALT、AST、CK、LDH和Cr均极显著升高(P<0.01),肝脏和心脏实质细胞主要表现为以急性退行性变化为主要特征的急性损伤。Hsp27的表达水平在运输2h后的心脏内和运输4h的肝脏内显著升高(P<0.01),同时伴有hsp27mRNA在运输1h后的心脏和肝脏内的显著升高.01)。a B-crystallin在整个运输过程中的心脏和肝脏中的表达规律起伏不定(P>0.05),但是,αB-crystallin mRNA水平在运输1h后的心脏中显著升高,而在运输1h和2h的肝脏中却显著降低。结论：心脏和肝脏细胞的损伤在运输1h后最明显,Hsp27和αB-crystallin的表达在猪的运输过程中显示出了组织特异性。运输应激后猪胃脏黏膜皱褶上的主细胞有不同程度的脱落。表明经过4h的运输后,猪胃黏膜的完整性遭到破坏。运输2h后,胃组织中的Hsp90表达量显著下降(P<0.01),但经过1h、2h和4h运输后,各组猪胃脏中Hsp70水平均显著高于对照组(P<0.05)。Hsp27的表达水平在整个运输过程中相对稳定。胃中αB-crystallin的表达在运输4h后显著高于对照组(P<0.05)。HSPs的不同表达变化提示不同的Hsp在运输应激猪胃中发挥不同的功能。调节HSPs表达的HSF-1的水平在运输过程中基本保持稳定。提示在运输应激过程中,HSF-1不是调节HSPs表达的唯一因素。运输1h和2h后,猪背最长肌肉的初始和最终pH(pHi和pHu)均降低,汁液损失和L*值与对照组相比均升高,显示出PSE肉的特征。运输2h后的肉质低于运输1h和4h。运输应激后,四种被检热休克蛋白(αB-c、Hsp27、Hsp70和Hsp90)在猪背最长肌中的表达均呈降低趋势。导致运输应激后猪背最长肌肉品质下降的可能原因之一是HSPs的表达降低。体外实验结果显示：培养液中ALT、LDH、CK、CKMB在热应激后均有不同程度的升高。免疫组化结果显示,在热应激过程中,Hsp27在心肌细胞的细胞核和细胞浆中分布不同,HSF-1则相对稳定的分布于细胞核中。Wsstern Blot结果显示Hsp27的表达在热应激8h后显著升高,HSF-1的表达在热应激10 min、40 min、60 min和120 min时显著降低,而在240 min后极显著升高。荧光定量PCR检测结果显示hsp27mRNA和hsf-1 mRNA在热应激10 min后均显著或极显著升高。结果表明在持续热应激后,大鼠心肌细胞受到一定的损伤；Hsp27在热应激过程中发挥一定的作用；Hsp27和HSF-1的表达与其相应mRNA水平不同步,可能与其在热应激过程中被磷酸化有关。流式细胞仪检测结果表明,除热应激40 min和480 min时,细胞凋亡率分别极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)高于相应的对照组外,热应激处理的其它各试验组离体培养的心肌细胞的凋亡率与相应对照组相比,差异均不显著。表明急性热应激可以诱导细胞启动某种自我保护机制以适应外界环境的改变。蛋白定量检测结果显示,在应激20 min后,Cleaved caspase-3极显著升高,并持续到热应激480 min后。Cyt c的水平与Cleaved caspase-3类似,提示两者变化在热应激过程中关系密切。

全文目录

摘要  9-11
ABSTRACT  11-15
第一章应激与热休克蛋白  15-39
  1 应激概述  15-17
    1.1 应激的概念  15
    1.2 应激时机体的神经内分泌反应  15-16
    1.3 应激时机体呈现的全身性适应综合征  16-17
  2 猪的运输应激  17-19
    2.1 猪的运输应激  17-18
    2.2 猪常见的应激性疾病  18-19
  3 热休克蛋白概述  19-30
    3.1 热休克蛋白的概念  19
    3.2 热休克蛋白的分类  19-20
    3.3 热休克蛋白的生物学特点  20-21
      3.3.1 高度保守  20-21
      3.3.2 普遍存在  21
      3.3.3 非特异性  21
      3.3.4 其他特点  21
    3.4 热休克蛋白的生物学功能  21-25
      3.4.1 分子伴侣(Molcuar chaperones)  21-22
      3.4.2 提高细胞抗应激能力  22
      3.4.3 调节细胞凋亡  22-23
      3.4.4 参与免疫调节  23-25
      3.4.5 抗氧化作用  25
      3.4.6 抗辐射作用  25
    3.5 热休克蛋白的表达与调控  25-27
      3.5.1 HSF1的结构及功能  26
      3.5.2 HSF1的作用机制  26-27
      3.5.3 热休克蛋白在翻译水平上的调控  27
    3.6 Hsp27和αB-crystallin的研究进展  27-30
      3.6.1 Hsp27和αB-crystallin的结构  27-28
      3.6.2 Hsp27和αB-crystallin的磷酸化  28
      3.6.3 Hsp27和αB-crystallin与疾病  28-30
  参考文献  30-39
第二章运输应激过程中猪心脏和肝脏中Hsp27和αB-crystallin及其相应mRNA的表达变化与应激性损伤的研究  39-59
  1 材料与方法  41-45
    1.1 试验设计  41
    1.2 主要仪器及试剂  41-42
    1.3 试验方法  42-45
      1.3.1 血液中ALT、AST、CK、LDH、Cr和BUN的检测  42
      1.3.2 病理组织学检测  42
      1.3.3 ELISA检测组织中的Hsp27和αB-crystallin水平  42-43
      1.3.4 实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测组织中HSPs mRNA  43-45
    1.4 统计分析  45
  2 结果  45-56
    2.1 运输应激后猪血清中ALT、AST、CK、LDH、Cr和BUN的变化  45-48
    2.2 运输应激受试猪主要脏器组织的组织病理学变化  48-50
    2.3 运输应激受试猪主要脏器组织中HSPs的表达变化  50-52
      2.3.1 运输应激受试猪心脏中Hsp27和αB-c的表达变化  50-51
      2.3.2 肝脏中Hsp27和αB-c的表达变化  51-52
    2.4 实时荧光定量PCR(FQ RT-PCR)检测各脏器组织中hsp27 mRNA和αB-cmRNA的转录变化  52-56
      2.4.1 hsp27 mRNA和αB-c mRNA及内参GAPDH的标准曲线  52-54
      2.4.2 hsp27 mRNA和αB-c mRNA在主要脏器组织中的转录变化  54-56
  3 讨论  56-59
第三章运输应激过程中HSPs在猪胃中的表达与应激性损伤研究  59-69
  1 材料与方法  61-63
    1.1 试验设计  61
    1.2 主要试剂  61
    1.3 试验方法  61-63
      1.3.1 ELISA检测HSPs在胃中的表达  61-62
      1.3.2 病理组织学检测  62-63
  2 结果  63-66
    2.1 运输应激后猪胃的病理组织学变化  63
    2.2 HSPs及HSF-1在胃组织中的表达  63-66
  3 讨论  66-69
第四章运输应激对受试猪肉品品质的影响  69-77
  1 材料与方法  70-72
    1.1 试验动物及试验设计  70
    1.2 主要仪器  70
    1.3 实验方法  70-71
      1.3.1 pH值测定  70-71
      1.3.2 持水性  71
      1.3.3 嫩度  71
      1.3.4 肉色  71
    1.4 统计分析  71-72
  2 结果  72-74
    2.1 肉质检测  72-73
    2.2 不同家族HSPs在肌肉组织中的表达  73-74
  3 讨论  74-77
第五章持续热应激对离体培养大鼠心肌细胞中Hsp27表达及其相应mRNA转录变化的影响  77-91
  1 材料与方法  78-82
    1.1 实验动物及主要试剂  78-79
    1.2 大鼠心肌细胞的原代培养及热应激处理  79
      1.2.1 心肌细胞的分离  79
      1.2.2 心肌细胞的培养及热应激处理  79
    1.3 实验方法  79-82
      1.3.1 细胞培养液中细胞特异性酶的检测  79
      1.3.2 免疫组织化学定位离体培养心肌细胞中HSPs  79-80
      1.3.3 Western Blot检测法定量检测离体培养心肌细胞中HSPs表达量  80-81
      1.3.4 实时荧光定量PCR检测离体培养心肌细胞中HSPs转录水平  81-82
    1.4 统计分析  82
  2 结果  82-87
    2.1 培养液中反映细胞损伤的特异性酶的变化  82-83
    2.2 HSPs的免疫组织化学定位检测结果  83-84
    2.3 Western Blot定量检测热应激处理心肌细胞中HSPs的表达水平  84-86
    2.4 FQ-RT PCR检测离体培养心肌细胞中HSPs转录水平  86-87
  3 讨论  87-91
第六章持续热应激诱导离体培养大鼠心肌细胞凋亡及相关信号转导分子表达的变化  91-101
  1 材料与方法  92-95
    1.1 实验动物及主要试剂  92-93
    1.2 大鼠心肌细胞的原代培养及热应激处理  93
      1.2.1 心肌细胞的分离  93
      1.2.2 心肌细胞的培养及热应激处理  93
    1.3 实验方法  93-95
      1.3.1 Western Blot检测法定量检测离体培养心肌细胞中细胞凋亡特异性蛋白的表达量  93-94
      1.3.2 流式细胞仪检测细胞凋亡  94-95
    1.4 统计分析  95
  2 结果  95-98
    2.1 流式细胞仪检测凋亡结果  95-96
    2.2 Western Blot  96-98
  3 讨论  98-101
参考文献  101-115
全文总结  115-117
附录  117-119
致谢  119-121
攻读博士学位期间发表的论文  121

应激过程中组织和细胞内HSPs表达与应激性损伤机理研究

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