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铁基/硅基智能纳米药物控制释放系统的构建与生物学评价

作　者: 罗忠
导　师: 蔡开勇；邓林红
学　校: 重庆大学
专　业: 生物医学工程
关键词: Fe3O4磁性纳米颗粒介孔硅纳米颗粒纳米储存器刺激响应性智能药物控释系统
分类号: TB383.1
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

纳米技术与材料学、生物学及医学的融合,促使“纳米生物医学”迅速发展,在减缓患者痛苦,改善人类健康领域发挥着重要的作用。尤其是利用纳米材料作为抗肿瘤药物的载体,构建智能响应性控释系统;可实现药物的缓释并稳定血药浓度,从而降低其对病人的毒副作用,提高肿瘤的治疗效果。新型的智能药物控释系统不仅能特异性识别靶位组织,还能定时、定量的将所需剂量的药物导入病灶部位,针对病变细胞实行定向“爆破”,提高药物的利用率,在临床治疗中具有潜在的应用前景。过去十来年,磁性纳米材料和介孔硅纳米材料受到研究人员的广泛关注。磁性纳米材料作为高效的药物和分子探针载体,应用于生物医学领域的磁场定点治疗和核磁成像（MRI）造影剂等。介孔硅纳米颗粒的介孔结构高度规则有序、比表面积大及孔径尺寸可调等优点,已经被开发成新型的生物相容性药物纳米储存器,在药物与基因递送方面展示了广阔的应用价值。但是,其存在的共同问题是:①如何构建生物信号响应型新型纳米药物控释系统,使其能特异性识别病变细胞并实施靶向给药,提高药物的细胞吞噬效率;②如何评价纳米颗粒与细胞间的相互作用机理,从而为其在生物体内的安全使用提供理论依据。基于上述问题,本文利用磁性纳米材料及介孔硅纳米材料作为药物载体,并对其表面进行特异性生物功能化,构建了具有还原响应性磁性分子纳米储存器释放系统、远程磁控可逆型药物释放微芯片、还原响应性细胞靶向介孔硅/胶原纳米复合控制释放系统与细胞内pH-响应性介孔硅/牛血清蛋白多功能复合型纳米药物控释系统。同时,本文对介孔硅纳米复合控释系统与肝癌细胞间的靶向作用机理和吞噬机制做了科学的生物学评价,研究了介孔硅/蛋白质纳米复合颗粒与巨噬细胞间的炎症响应性,为设计特异性靶向药物控释系统奠定了理论基础。本文的主要研究内容和结论如下:1.基于Fe₃O₄磁性纳米颗粒构建还原响应性分子纳米储存器并进行生物学评价。本文以磁性纳米颗粒为载体,二硫键偶联β-环糊精接枝的聚乙烯亚胺分子,构建了新型还原响应性分子纳米储存器控释系统（MNPs-S-S-PEI/β-CD）。扫描电镜及透射电镜结果表明MNPs-S-S-PEI/β-CD纳米复合颗粒呈球状,粒径为160±32 nm。红外光谱、Zeta电位、热重分析和荧光胺检测证实MNPs-S-S-PEI/β-CD纳米复合颗粒的制备过程成功可控。透射电镜结果表明磁性纳米颗粒、MNPs-S-S-PEI/β-CD纳米复合颗粒被细胞吞噬后分布于细胞胞质内,不与细胞核发生作用。同时,利用喜树碱（CAMP）作为抗癌模型药物,构建MNPs-S-S- PEI/β-CD@CAMP纳米复合系统;并利用细胞活性检测（MTT）、共聚焦细胞形态观察及DNA凋亡试剂盒等考察了该纳米复合颗粒被肝癌细胞吞噬后,所诱发的凋亡作用机理。2.基于Fe₃O₄磁性纳米颗粒制备远程磁控可逆型药物释放微芯片。本文利用Fe₃O₄磁性纳米颗粒作为磁场纳米控制器,微阵列式聚乳酸微芯片作为基质,聚碳酸酯核孔膜作为封装膜,构建出远程磁控植入式可逆型聚乳酸药物控释微芯片。利用机械精密慢走线技术及软印刷技术制备了9×9阵列式聚乳酸微芯片。以水热法合成了粒径均匀的Fe₃O₄纳米颗粒,粒径分布为196.1±19.8 nm,磁化强度为76.8 emu/g。通过外加磁场控制Fe₃O₄纳米颗粒的运动与聚集状态,从而有效地“封堵”或“开启”聚乳酸微芯片表面的聚碳酸酯核孔膜,实现远程磁控可逆型聚乳酸微芯片的构建。扫描电镜及透射电镜结果进一步表明聚乳酸9×9阵列式药物微芯片的制备过程成功可控。DNA及VB2模型药物的释放特性证实了聚乳酸药物控释微芯片可实现远程磁控可逆式脉冲释放。3.还原响应性细胞靶向介孔硅/胶原纳米复合控制释放系统的构建与生物学评价。本文利用乳糖酸接枝胶原分子作为纳米封装器,二硫键为联接纽带,介孔硅颗粒为纳米储存器,构建了还原响应性纳米储存器控释系统（LA-Col- Linker-MSN）。介孔硅纳米颗粒粒径分布均匀,直径为130 nm,介孔尺寸为3.8 nm,比表面积达889 cm3/g。乳糖酸分子是ASGP-R的一种特异配体,能与肝癌细胞（HepaG2）膜上的受体发生特异性识别作用。扫描电镜、透射电镜、比表面及孔隙度分析仪、红外光谱及Zeta电位检测结果表明LA-Col-Linker-MSNs复合系统已成功制备。利用二硫苏糖醇（DTT）作为刺激信号,考察了该控释系统的还原响应性药物释放特性。激光共聚焦及流式细胞仪结果表明LA-Col-Linker-MSNs/FITC纳米复合颗粒能被HepaG2细胞所特异性识别并高效内吞,并分布于细胞胞质内,实现还原响应性细胞靶向药物控释系统的构建。4.细胞内pH-响应性抗癌介孔硅/牛血清蛋白复合型纳米药物控释系统的构建与生物学评价。利用乳糖酸接枝牛血清蛋白为有机大分子纳米塞,4-羧基苯丙硼酸为连接纽带,介孔硅纳米颗粒为纳米储存器,构建了新型多功能pH-响应性纳米复合控释系统（LA-BSA-CBA-MSNs）。扫描电镜、透射电镜、红外光谱、Zeta电位仪、热重分析仪、比表面及孔隙度分析仪结果均表明LA-BSA-CBA-MSNs纳米复合系统已成功制备。其在不同pH环境下的阿霉素释放结果,表明LA-BSA-CBA-MSNs纳米复合系统具有pH-响应性。激光共聚焦及透射电镜结果表明复合系统可被细胞高效吞噬,并分布于细胞质内,未嵌入至细胞核内。吞噬机制的研究结果表明肝癌细胞是通过受体介导的吞噬方式,摄入LA-BSA-CBA-MSNs纳米复合颗粒。细胞核形态观察及DNA凋亡试剂盒检测结果表明LA-BSA-CBA-MSNs@DOX能被肝癌细胞吞噬,从而诱发细胞的凋亡或死亡。5.介孔硅纳米材料与介孔硅/蛋白质纳米复合颗粒的制备以及炎症响应性评价。本文利用明胶（Gel）、牛血清蛋白（BSA）及溶菌酶（Lys）为有机大分子纳米塞,丁二酸酐为连接纽带,介孔硅颗粒为纳米储存器载体,构建了蛋白质/介孔硅类纳米复合系统。利用扫描电镜、透射电镜图、红外光谱、Zeta电位仪表征了SiO2、MSNs、Gel-MSNs、BSA-MSNs及Lys-MSNs等纳米复合颗粒的制备过程。重点研究了巨噬细胞与SiO2、MSNs以及蛋白质/介孔硅纳米复合颗粒的炎症响应,包括细胞形态特征、细胞活性、NO及ROS的表达、酸性磷酸酶的活性表达水平、炎症因子（TNF-α和IL-1β）的表达水平等。结果表明SiO2、MSNs等纳米颗粒被巨噬细胞吞噬后,提高了巨噬细胞的激活水平,从而诱发炎症;而Gel-MSNs、BSA-MSNs及Lys-MSNs等纳米复合颗粒与巨噬细胞发生作用后,会降低巨噬细胞的激活程度和炎症响应性,从而减少其在生物体内的免疫抗原反应。

全文目录

中文摘要  3-6
英文摘要  6-14
1 绪论  14-44
  1.1 问题的提出及研究意义  14-15
    1.1.1 Fe_3O_4 磁性纳米材料在生物医学领域的研究现状  14-15
  1.2 磁性纳米颗粒/介孔硅在智能药物控制系统的应用  15-38
    1.2.1 磁性纳米材料作为药物载体的提出  15-25
    1.2.2 介孔硅纳米材料（MSNs）在生物医学领域的研究现状  25-37
    1.2.3 Fe_3O_4 磁性纳米材料及介孔硅纳米材料（MSNs）在智能药物控制释放领域中存在的问题  37-38
  1.3 研究思路及主要研究内容  38-42
    1.3.1 研究思路  38-40
    1.3.2 研究内容  40-42
  1.4 本文的创新点  42-44
2 基于磁性纳米颗粒构建还原响应性分子纳米储存器释放系统以及生物学评价  44-66
  2.1 前言  44-46
  2.2 实验部分  46-51
    2.2.1 实验材料与设备  46-47
    2.2.2 Fe_3O_4 材料的制备与表征  47
    2.2.3 还原响应性分子纳米储存器的制备与表征  47-49
    2.2.4 功能药物的封装与测定  49-50
    2.2.5 还原响应性分子纳米储存器控释系统的还原响应性和释放行为  50
    2.2.6 细胞的响应性检测  50-51
  2.3 结果与讨论  51-64
    2.3.1 Fe_3O_4 纳米材料的表征  51-52
    2.3.2 核磁共振的表征  52-53
    2.3.3 还原响应性分子纳米储存器的表征  53-58
    2.3.4 纳米复合系统的还原响应性行为和释放特性  58-60
    2.3.5 细胞响应性检测  60-64
  2.4 小结  64-66
3 基于 Fe_3O_4磁性纳米颗粒制备远程磁控可逆型药物释放微芯片  66-84
  3.1 前言  66-68
  3.2 实验部分  68-72
    3.2.1 实验材料及设备  68
    3.2.2 材料的制备与表征  68-70
    3.2.3 远程磁控聚乳酸微阵列药物释放微芯片的构建  70
    3.2.4 远程磁控聚乳酸微阵列药物释放微芯片的的表征  70
    3.2.5 远程磁控聚乳酸微芯片的药物释放特性  70-72
  3.3 结果与讨论  72-81
    3.3.1 Fe_3O_4 磁性纳米颗粒、高炭钢（高硬度）模具、锡板模具、PDMS 印章、及聚乳  酸微芯片的制备与表征  72-76
    3.3.2 远程磁控聚乳酸微芯片释放系统的表征  76-77
    3.3.3 远程磁控聚乳酸微芯片释放性能  77-81
  3.4 小结  81-84
4 还原响应性细胞靶向介孔硅/胶原纳米复合控制释放系统的构建与生物学评价  84-104
  4.1 前言  84-85
  4.2 实验部分  85-90
    4.2.1 实验材料与设备  85-86
    4.2.2 介孔硅纳米材料的制备  86-87
    4.2.3 二硫键功能化介孔硅纳米材料的制备  87-88
    4.2.4 还原响应性介孔硅/胶原复合系统的构建  88
    4.2.5 还原响应性细胞靶向介孔硅/胶原复合系统的构建  88
    4.2.6 还原响应性细胞靶向介孔硅/胶原复合系统的表征  88
    4.2.7 介孔硅/胶原复合系统的还原响应性释放行为  88-89
    4.2.8 细胞响应性检测  89-90
  4.3 结果与讨论  90-101
    4.3.1 介孔硅纳米材料的表征  90
    4.3.2 还原响应性细胞靶向介孔硅/胶原复合系统的表征  90-96
    4.3.3 介孔硅/胶原纳米复合系统的还原响应性释放特性  96-98
    4.3.4 细胞响应  98-101
  4.4 小结  101-104
5 细胞内pH-响应性介孔硅/牛血清蛋白复合型纳米药物控释系统的构建与生物学评价  104-130
  5.1 前言  104-106
  5.2 实验部分  106-111
    5.2.1 实验材料与设备  106-107
    5.2.2 介孔硅纳米材料的制备与表征  107
    5.2.3 硼酸化介孔硅纳米材料的制备与表征  107-108
    5.2.4 pH-响应性细胞靶向介孔硅/蛋白质复合系统的构建与表征  108-109
    5.2.5 介孔硅/牛血清蛋白复合系统的pH-响应性释放行为  109
    5.2.6 细胞的响应性检测  109-111
  5.3 结果与讨论  111-127
    5.3.1 介孔硅纳米材料的制备与表征  111-112
    5.3.2 pH-响应性细胞靶向介孔硅/蛋白质复合系统的构建与表征  112-117
    5.3.3 介孔硅/牛血清多功能纳米复合系统的pH-响应性释放特性  117-118
    5.3.4 细胞响应性检测  118-127
  5.4 小结  127-130
6 介孔硅/蛋白质纳米复合颗粒的制备以及炎症响应性评价  130-150
  6.1 前言  130-131
  6.2 实验部分  131-136
    6.2.1 实验材料与设备  131-132
    6.2.2 介孔硅（MSNs）和实心硅（Si02）纳米颗粒的制备与合成  132-133
    6.2.3 介孔硅/蛋白质复合纳米颗粒的制备与表征  133-134
    6.2.4 细胞的响应性检测  134-136
  6.3 结果与讨论  136-148
    6.3.1 SiO_2、介孔硅(MSN)纳米颗粒的合成与表征  136-137
    6.3.2 Gel-MSNs, BSA-MSNs 及Lys-MSNs 的表征  137-140
    6.3.3 细胞形态观察  140-142
    6.3.4 细胞活性检测  142-143
    6.3.5 NO 的释放  143-144
    6.3.6 活性氧（ROS）的检测  144-146
    6.3.7 酸性磷酸酶活性检测  146
    6.3.8 炎症因子的表达  146-148
  6.4 小结  148-150
7 主要结论与后续建议  150-154
  7.1 主要结论  150-152
  7.2 后续工作建议  152-154
致谢  154-156
参考文献  156-178
附录  178-180
  A 作者攻读学位期间发表的文章  178-179
  B 作者攻读学位期间取得的科研成果目录  179
  C 作者攻读学位期间参加或主持的科研项目  179-180

铁基/硅基智能纳米药物控制释放系统的构建与生物学评价

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