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层层自组装技术在聚乳酸及钛材表面工程的应用

作　者: 胡燕
导　师: 蔡开勇；王远亮
学　校: 重庆大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 层层自组装技术 聚乳酸 钛材 基因活化生物材料 纳米储存器
分类号: R318.08
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


生物材料的表面性质对于调控细胞与材料间的相互作用,包括细胞在生物材料表面粘附、迁移及分化等生物学行为具有至关重要的作用。从某种意义上讲,生物材料界面就是材料与生命之间的纽带。如何进行生物材料表面功能化、进而调控细胞生理功能,对生物材料的研究/设计提出了更高的要求。随着生物材料的发展,新型生物材料的设计被期望具有在分子水平刺激特异性细胞/基因响应的能力,达到界面调控细胞命运的目的。在过去几十年,聚乳酸及钛材作为植入体,被广泛地应用于临床治疗。然而,聚乳酸及钛材自身生物相容性差,缺乏诱导组织形成性能,是其临床应用面临的普遍挑战。很多诸如感染、移位、异体反应、纤维包囊及植入体与骨组织界面的细胞死亡等因素都可能导致植入失败。基于聚乳酸及钛材所存在的问题,为了实现界面调控细胞生物学行为,诱导损伤组织的修复,急需发展新的研究思路及技术手段。层层自组装技术（Layer-by-Layer assembly technique, LBL）是基于静电相吸而形成多层膜自组装体系的技术,是一种简单而又高效地构建生物活性表面的方法。本论文利用层层自组装技术并结合基因释放/治疗,在聚乳酸及钛材表面构建生物活性界面及细胞响应性储存器系统,目的是改善材料界面的细胞诱导性能,为开发新型聚乳酸及钛材骨植入体奠定基础。本文的主要研究内容和结论如下:1.利用层层自组装技术在聚乳酸表面构建壳聚糖（Chi）/DNA多层膜结构,并建立DNA释放模型。用红外光谱（FITR）、X光电子能谱（XPS）、原子力显微镜（AFM）以及接触角测试仪表征多层膜的沉积过程。接触角测试表明:从第五层起,Chi/DNA层状结构开始形成。XPS及AFM分别证实了最外层组分决定了多层膜表面的化学性质和表面拓扑结构。DNA释放行为显示在溶菌酶的存在下,DNA在32小时内可缓慢释放到溶液中。2.利用层层自组装技术构建基因功能化聚乳酸表面调控细胞特异性/非特异性转染及机理研究。本研究首先合成了三种不同的聚合物,即半乳糖苷化壳聚糖（galactosylated chitosan,GC）、半乳糖苷化聚乙烯亚胺（galactosylated polyethylenimine, GP）及环糊精接枝的聚乙烯亚胺（cyclodextrin grafted polyethylenimine, PEI-CD）。利用层层自组装技术,将三种聚合物作为聚阳离子在聚乳酸表面构建含质粒DNA （pDNA）的多层膜。接触角测试和原子力显微镜表征了GC/pDNA多层膜的组装过程,结果表明从第四层开始完整的单层膜开始形成。pDNA可从PDLLA/PEI/（pDNA/GC）5/pDNA多层膜持续释放42小时以上。GC/DNA多层膜修饰的PDLLA基材有利于细胞的生长,而且经过半乳糖接枝的壳聚糖或聚乙烯亚胺能够通过受体介导的细胞胞吞途径提高基因转染率,实现界面介导的细胞特异性基因原位转染。同时,PDLLA/（PEI-CD/pDNA）6多层膜系统也证实了界面调控细胞非特异性基因原位转染的可行性。TEM观察及抗DNA酶作用的结果表明材料表面介导基因原位转染的机制为:伴随多层结构膜降解,原位形成了质粒DNA复合物颗粒,培养在多层结构膜上的细胞原位吞噬该颗粒,实现了原位基因转染。3.利用层层自组装技术在钛材表面构建基因活化界面,调控骨髓间充质干细胞（MSCs）的原位分化。为了进一步研究界面调控基因转染机制,利用层层自组装技术在钛膜表面构建质粒DNA/壳聚糖多层膜,考察骨髓间充质干细胞的分化行为。质粒pEGFP- hBMP2 （pGB）能表达绿色荧光蛋白GFP及骨形态发生蛋白BMP2。随着多层膜降解,质粒DNA复合物颗粒从多层膜中持续形成,进而原位转染骨髓间充质干细胞。GFP、hBMP2 mRNA、碱性磷酸酶及骨钙素的表达证实了骨髓间充质干细胞的转染及向成骨细胞的分化,实现了基因活化钛材表面诱导干细胞原位分化。4.利用层层自组装技术在钛材表面构建壳聚糖、丝素蛋白多层膜并考察多层膜对成骨细胞生长行为的影响。用层层自组装技术在钛膜表面构建壳聚糖/丝素蛋白、壳聚糖/聚苯乙烯磺酸钠类细胞外基质多层膜结构。接触角结果表明从第五层起,Chi/SF及Chi/PSS层状结构均开始形成。XPS及AFM分别证实了最外层组分决定了多层膜表面的化学性质和表面拓扑结构。成骨细胞增殖、活性、碱性磷酸酶表达及DNA总含量的检测结果表明Chi/SF及Chi/PSS多层膜涂层的钛膜具有较好的生物相容性,能促进骨的形成。5.利用层层自组装技术在钛材表面构建纳米存储器,调控骨的动态平衡。运用层层自组装技术将载药介孔硅纳米颗粒组装到钛材表面。介孔硅作为纳米存储器储存β-雌二醇。主要考察了钛材表面纳米存储器的组装过程及细胞在该钛材表面的生物学响应行为。TGA分析显示β-雌二醇通过简单的扩散平衡可以负载到介孔硅中。Zeta电位检测结果表明在MSN表面成功构建壳聚糖（Chi）/明胶（Gel）多层膜,即E2-MSN@PEM。扫描电镜观察反映出E2-MSN@PEM纳米颗粒被成功组装到钛膜表面,即激素功能化钛材或杂化膜修饰的钛材。成骨细胞碱性磷酸酶的活性、矿化能力及OPG、OPN mRNA的表达验证该系统具有良好的细胞相容性及诱导骨形成性能。同时,该系统还有抑制破骨细胞功能表达的能力,及调控成骨细胞/破骨细胞动态平衡,为骨质疏松病患接受骨植入体治疗提供了新思路。6.利用层层自组装技术构建细胞因子活化TiO2纳米管调控骨髓间充质干细胞的迁移及分化。运用旋转涂布层层自组装技构建细胞因子活化的TiO2纳米管。首先用阳极氧化法制备TiO2纳米管,作为细胞因子BMP2纳米存储器。在负载BMP2的TiO2纳米管表面构建壳聚糖（Chi）/明胶（Gel）,即TiO2/BMP2/LBL。扫描电镜观察及接触角结果表明运用旋转涂布层层自组装技术可在TiO2/BMP2构建Chi/Gel多层膜保护层。SOD活性检测表明Chi/Gel多层膜可以保护SOD的活性,延长其使用寿命。与其它TiO2样本相比较, TiO2/BMP2/LBL体系更有利于促进MSCs的迁移及分化。7.利用层层自组装技术构建骨细胞微环境调控骨髓间充质干细胞的分化及促进体内骨生成。运用层层自组装技术构建具有骨诱导性能的生物功能化、多层膜覆盖的TC4植入体,及TC4/LbL/BMP2/FN系统。随着多层膜的降解,BMP2长时间内持续释放。ALP的表达,细胞矿化及成骨细胞基因（Runx2, Osterix, OCN, OPN, ALP and ColⅠ）的检测结果表明多层膜结构可促进体外MSCs的粘附及分化。体内Micro-CT及组织学分析表明TC4/LbL/BMP2/FN植入体能有效诱导植入体/原生骨界面的新骨生成。

全文目录


中文摘要  3-6
英文摘要  6-15
主要缩略词  15-17
1 绪论  17-37
  1.1 问题的提出及研究意义  17-20
    1.1.1 聚乳酸的研究现状  17-18
    1.1.2 钛材的研究现状  18-19
    1.1.3 聚乳酸及钛材普遍存在的问题  19-20
  1.2 层层自组装技术  20-33
    1.2.1 层层自组装技术的原理及性能  20-21
    1.2.2 层层自组装技术在医学领域中的应用  21-33
  1.3 研究思路及主要研究内容  33-35
    1.3.1 研究思路  33-34
    1.3.2 研究内容  34-35
  1.4 本文的创新点  35-37
2 聚乳酸表面壳聚糖/DNA 多层膜的构建  37-47
  2.1 前言  37-38
  2.2 实验部分  38-41
    2.2.1 实验材料与设备  38-39
    2.2.2 聚乳酸表面壳聚糖/DNA 多层膜的构建  39
    2.2.3 壳聚糖/DNA 多层膜化聚乳酸的表征  39-40
    2.2.4 壳聚糖/DNA 多层膜的降解及DNA 的释放研究  40-41
  2.3 结果与讨论  41-45
    2.3.1 红外光谱检测  41
    2.3.2 XPS 表征  41-43
    2.3.3 接触角的检测  43
    2.3.4 拓扑结构的表征  43-44
    2.3.5 多层膜的降解与DNA 的释放  44-45
  2.4 小结  45-47
3 基因功能化聚乳酸表面调控细胞特异性/非特异性基因原位 转染及机理  47-77
  3.1 前言  47-48
  3.2 实验部分  48-54
    3.2.1 实验材料及设备  48-49
    3.2.2 材料的制备与表征  49-51
    3.2.3 聚乳酸表面GC/pDNA、GP/pDNA 及PEI-CD/ pDNA 多层膜的构建  51-52
    3.2.4 多层膜的表征  52
    3.2.5 多层膜的降解与质粒DNA 的释放  52-53
    3.2.6 基因活化聚乳酸表面生物相容性检测  53
    3.2.7 基因活化聚乳酸表面基因原位转染  53-54
    3.2.8 界面介导的基因原位转染机制研究  54
  3.3 结果与讨论  54-74
    3.3.1 LA-NHS 酯、GC、GP 及PEI-CD 的合成与表征  54-63
    3.3.2 多层膜的表征  63-66
    3.3.3 多层膜降解与DNA 的释放  66-67
    3.3.4 细胞相容性检测  67-69
    3.3.5 材料表面介导细胞特异性基因原位转染  69-73
    3.3.6 材料表面介导基因原位转染的机制  73-74
  3.4 小结  74-77
4 基因活化钛材表面原位介导骨髓间充质干细胞的分化  77-93
  4.1 前言  77-78
  4.2 实验部分  78-83
    4.2.1 实验材料与设备  78-80
    4.2.2 质粒pEGFP-hBMP2（pGB）的构建  80
    4.2.3 基因活化钛材表面的构建  80
    4.2.4 钛材表面壳聚糖/pGB 多层膜的表征  80
    4.2.5 多层膜的降解与质粒DNA 的释放行为  80-81
    4.2.6 基因活化钛材表面基因的原位转染  81-82
    4.2.7 细胞响应性检测  82-83
  4.3 结果与讨论  83-92
    4.3.1 转基因载体pEGFP–hBMP2 的构建  83-84
    4.3.2 接触角检测  84
    4.3.3 多层膜的降解与质粒DNA 的释放  84-86
    4.3.4 体外基因转染  86-87
    4.3.5 RT-PCR  87-88
    4.3.6 细胞响应  88-92
  4.4 小结  92-93
5 钛膜表面壳聚糖、丝素蛋白多层膜的构建及细胞响应性研究  93-109
  5.1 前言  93-94
  5.2 实验部分  94-97
    5.2.1 实验材料与设备  94-95
    5.2.2 钛膜表面壳聚糖(Chi)  95
    5.2.3 钛膜表面Chi/SF 及Chi/PSS 多层膜的表征  95-96
    5.2.4 细胞在Chi/SF 及Chi/PSS 多层膜修饰的钛膜表面的响应研究  96-97
  5.3 结果与讨论  97-107
    5.3.1 钛材表面Chi/SF 多层膜的表征  97-100
    5.3.2 Chi/SF 多层膜修饰的钛材表面细胞响应研究  100-102
    5.3.3 钛材表面Chi/PSS 多层膜的表征  102-105
    5.3.4 Chi/PSS 多层膜修饰的钛膜表面成骨细胞的响应研究  105-107
  5.4 小结  107-109
6 钛材表面激素功能化介孔硅的层层自组装及其在骨动态平衡中的应用  109-127
  6.1 前言  109-112
  6.2 实验部分  112-116
    6.2.1 材料与设备  112
    6.2.2 介孔硅的制备与表征  112-113
    6.2.3 介孔硅的药物装载及表征  113
    6.2.4 载药介孔硅表面多层膜修饰及表征  113
    6.2.5 钛材表面激素功能化介孔硅多层膜的构建及表征  113-114
    6.2.6 多层膜的降解与药物的释放行为  114
    6.2.7 细胞在钛材表面激素功能化介孔硅多层膜上的响应性研究  114-116
  6.3 结果与讨论  116-126
    6.3.1 介孔硅纳米颗粒的合成与表征  116-117
    6.3.2 药物装载及表征  117-118
    6.3.3 E2-MSN@ PEM 体系的构建  118-119
    6.3.4 激素功能化钛材的表征  119-120
    6.3.5 Chi/Gel 多层膜的降解与药物的释放行为  120-121
    6.3.6 细胞活性检测  121-122
    6.3.7 碱性磷酸酶的表达  122-123
    6.3.8 矿化检测  123-125
    6.3.9 骨保护素及骨桥蛋白mRNA 的表达水平  125-126
  6.4 小结  126-127
7 细胞因子活化的 TO_2纳米管调控骨髓间充质干细胞迁移与分化  127-143
  7.1 前言  127-128
  7.2 实验部分  128-132
    7.2.1 实验材料与设备  128-129
    7.2.2 细胞因子活化TO_2 纳米管的制备  129-130
    7.2.3 细胞因子活化TO_2 纳米管表面壳聚糖/明胶多层膜的构建  130
    7.2.4 细胞因子活化TO_2 纳米管的表征  130
    7.2.5 SOD 活性检测  130-131
    7.2.6 骨髓间充质干细胞的原代培养及鉴定  131
    7.2.7 细胞因子活化TO_2 纳米管表面细胞形态学观察  131-132
    7.2.8 细胞迁移检测----伤口愈合测试  132
    7.2.9 细胞活性检测  132
    7.2.10 碱性磷酸酶的检测  132
  7.3 结果与讨论  132-142
    7.3.1 细胞因子活化TO_2 纳米管的表征  132-135
    7.3.2 SOD 活性检测  135-137
    7.3.3 细胞形态观察  137-138
    7.3.4 细胞迁移  138-140
    7.3.5 细胞活性  140
    7.3.6 碱性磷酸酶活性检测  140-142
  7.4 小结  142-143
8 钛合金表面细胞微环境的构建及其对干细胞分化和体内骨生成的调控  143-163
  8.1 前言  143-144
  8.2 实验部分  144-149
    8.2.1 实验材料与设备  144-145
    8.2.2 多层膜的构建  145-146
    8.2.3 多层膜的表征  146
    8.2.4 FN 沉积的免疫检测  146
    8.2.5 BMP2 释放研究  146
    8.2.6 间充质干细胞在TC4/LbL/rhBMP2/FN 表面的响应性研究  146-148
    8.2.7 体内试验  148-149
  8.3 实验结果与讨论  149-162
    8.3.1 多层膜结构的表征  149-150
    8.3.2 BMP2 体外释放研究  150-151
    8.3.3 细胞形态  151-152
    8.3.4 细胞分化  152-154
    8.3.5 定量PCR 分析  154-156
    8.3.6 破骨细胞分化  156-157
    8.3.7 体内试验  157-162
  8.4 小结  162-163
9 主要结论与后续建议  163-167
  9.1 主要结论  163-164
  9.2 后续工作建议  164-167
致谢  167-169
参考文献  169-197
附录  197-199
  A. 作者攻读学位期间发表的文章  197-199
  B. 作者攻读学位期间取得的科研成果目录  199
  C. 作者攻读学位期间参加的科研项目  199

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医用一般科学 > 生物医学工程 > 一般性问题 > 生物材料学
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