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Lactobacillus brevis NCL912的耐酸特性及其酸胁迫下差异表达蛋白的研究

作　者: 黄桂东
导　师: 曹郁生
学　校: 南昌大学
专　业: 食品科学与工程
关键词: 短乳杆菌NCL912 酸胁迫 酸应激反应 蛋白质组学 差异表达蛋白 L-谷氨酸钠 γ-氨基丁酸 谷氨酸脱羧酶
分类号: TS201.3
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


乳酸菌是一类非常重要的食品微生物,在食品中的应用可以追溯到数千年以前。它具有提高食品营养价值,改善食品风味,延长保存时间的功能,还具有多种有益于人类健康的活性。短乳杆菌是其中之一。近年来,短乳杆菌做为发酵剂、益生菌等被广泛应用在食品工业生产中。但是由于自身产酸,在保存、食用过程中也会遇到外界酸性环境的影响,使得短乳杆菌不可避免的面临酸胁迫。酸胁迫对短乳杆菌的存活、生长及生理活性有很大的影响。因此,为了生存、增殖并发挥其有益宿主健康的功能,短乳杆菌必须具有应对酸胁迫的能力,并对酸胁迫产生应激反应来保护其生存、增殖。如果能够找到提高乳酸菌耐酸能力的方法或途径,将会极大地推动乳酸菌在食品工业生产中的应用。从理论意义上,对酸胁迫下乳酸菌的蛋白质组学的深入研究,不仅可以了解乳酸菌在酸应激反应中蛋白质的表达变化,而且可以了解生物在逆境中的某些相关基因和蛋白质的功能,进而分析揭示其酸应激反应的机制。Lactobacillus brevis NCL912是本实验分离得到的一株乳酸菌,具有高效转化L-谷氨酸钠成为γ-氨基丁酸的能力。本论文主要研究了以下内容。1.观察了L. brevis NCL912在酸性环境下的生长及在pH 2.0极端酸性环境中的耐酸性能。结果表明,L. brevis NCL912在pH 3.5～6.4的酸性环境中可以生长,其最适生长pH是5.0。在pH 2.0的极端酸性培养基中,该菌能够存活4-6 h。2.比较了添加与未添加L-谷氨酸钠培养基培养的L. brevis NCL912的生长、存活、γ-氨基丁酸产量及谷氨酸脱羧酶活力,并对该菌的酸应激反应机制进行了分析。结果表明,添加L-谷氨酸钠培养基培养的L. brevis NCL912生长较好。在pH 3.5～5.0条件下,L. brevis NCL912可以完全利用培养基中添加的L-谷氨酸钠生成γ-氨基丁酸,γ-氨基丁酸的产量分别达10.77,11.44,10.94 g/L。在两种培养基中细菌的存活率和谷氨酸脱羧酶活力存在显著性差异（p<0.05）,添加L-谷氨酸钠培养基培养的细菌耐酸性强,酶活力高。说明L-谷氨酸钠对该菌在酸性环境中的生长、存活有重要的影响,其原因可能与γ-氨基丁酸的生成有关,即谷氨酸脱羧酶-γ-氨基丁酸逆向运输系统可能是该菌的酸应激反应机制。3.乳酸菌的酸应激反应是一个涉及到多个基因和蛋白质的复杂的网络调控体系。它不仅与依赖外部氨基酸的酸应激系统有关,而且菌体内部其他蛋白质也可能发生改变以应对酸胁迫。目前对短乳杆菌酸应激反应中菌体蛋白的差异表达及功能分析报道较少。因此,从蛋白质组学水平,对L. brevis NCL912在酸胁迫下菌体蛋白质的变化进行了研究。本研究得到了均匀、背景清晰、分辨率高、重复性好的L. brevis NCL912的双向凝胶电泳图谱。对pH 5.0和pH 4.0条件下培养的该菌总蛋白质电泳图谱进行比较,发现有25个差异表达蛋白,其中8个蛋白点得到了质谱鉴定。其中7个蛋白点表达上调,1个蛋白点表达下调。表达上调的7个蛋白点包括：酸应激蛋白2个,分别是通用应激蛋白UspA蛋白和含CBS结构域蛋白；与蛋白质合成有关的蛋白3个,分别是50S核糖体蛋白L10,核糖体循环因子和SSU核糖体蛋白S30P；与代谢相关的蛋白是依赖NADP的3-磷酸甘油醛脱氢酶；与核苷酸合成有关的蛋白是次黄嘌呤核苷酸脱氢酶。表达下调的蛋白是一个假设蛋白LVIS0520,其功能未知。在酸胁迫条件下,L.brevis NCL912 CBS结构域蛋白基因的mRNA表达水平呈显著上升（p<0.05）,与蛋白质图谱上蛋白表达水平的变化一致,说明该菌蛋白质和mRNA表达水平之间有较好的相关性。4.应用蛋白质组学技术,对添加L-MSG培养基培养的L. brevis NCL912在酸胁迫条件下的差异蛋白表达也进行了探讨。结果表明,在酸胁迫条件下,添加L-MSG培养基培养的L.brevis NCL912有26个蛋白发生了差异表达,其中11个蛋白得到了鉴定。这11个蛋白包括：通用应激蛋白UspA蛋白、热应激蛋白GrpE、3-磷酸甘油醛脱氢酶、核苷-二磷酸-糖差向异构酶、3-磷酸甘油酰基转移酶PlsX.磷脂结合蛋白、S-核糖同型半胱氨酸酶、延伸因子Tu、RNA结合蛋白以及假设蛋白BRAFLDAFT64486。转录学水平的验证表明该菌蛋白质和mRNA表达水平之间有较好的相关性。5.对添加与未添加L-谷氨酸钠培养基培养的L. brevis NCL912已鉴定蛋白质的功能进行了分析比较,发现在酸胁迫条件下,无论是否添加底物氨基酸,L.brevis NCL912都会启动一些共同的应激过程来保护自身,如蛋白质的合成、糖代谢及应激蛋白表达量的变化等。而外源氨基酸的添加可能会诱导某些与细胞膜及信号转导有关的蛋白表达发生改变,从而有利于细胞能够在酸性环境中生存和增殖。这表明酸胁迫应激过程是一个复杂的网络调控体系,不仅与外部氨基酸的添加有关,还涉及到菌体内部其他蛋白质的变化。为进一步了解乳酸菌酸应激反应机制提供了一定的参考和依据。

全文目录


摘要  8-10
Abstract  10-13
缩略词表  13-15
第1章 前言  15-34
  1.1 酸胁迫及其对乳酸菌生长的影响  15-16
    1.1.1 菌自身产酸导致的酸胁迫  15-16
    1.1.2 外界环境引起的酸胁迫  16
  1.2 提高乳酸菌耐酸能力的方法  16-18
    1.2.1 筛选和分离新菌株  16-17
    1.2.2 生物育种  17
    1.2.3 添加营养物质  17-18
    1.2.4 实施交叉应激  18
    1.2.5 酸适应性反应  18
  1.3 乳酸菌的酸应激反应机制  18-22
    1.3.1 维持pH的自我平衡(pH homeostasis)  18-20
    1.3.2 产生碱性物质  20-21
    1.3.3 酸应激反应的分子机制  21-22
    1.3.4 改变细胞膜组成  22
  1.4 蛋白质组学技术  22-24
    1.4.1 蛋白质组学概述  23
    1.4.2 蛋白质组学研究技术  23-24
  1.5 乳酸菌的蛋白质组学研究  24-27
    1.5.1 构建乳酸菌蛋白质组学2-DE图谱  25
    1.5.2 研究乳酸菌的功能及应用  25
    1.5.3 在适应性反应中的应用  25-26
    1.5.4 蛋白质组学在乳酸菌应激反应中的应用  26-27
  1.6. 研究展望及设想  27-28
  本章参考文献  28-34
第2章 L.brevis NCL912的耐酸性  34-41
  2.1 引言  34
  2.2 材料  34-35
    2.2.1 菌株  34
    2.2.2 培养基  34
    2.2.3 主要仪器和设备  34-35
    2.2.4 主要试剂  35
  2.3 方法  35-36
    2.3.1 L.brevis NCL912的培养  35
    2.3.2 L.brevis NCL912在不同酸性pH下的生长  35
    2.3.3 比生长速率的计算方法  35
    2.3.4 pH和GABA的测定方法  35-36
    2.3.5 L.brevis NCL912在pH2.0条件下的存活实验  36
  2.4 结果  36-38
    2.4.1 L.brevis NCL912的生长曲线及发酵培养液pH的变化  36-37
    2.4.2 发酵培养基中GABA的变化  37-38
    2.4.3 L.brevis NCL912在pH2.0条件下的存活情况  38
  2.5 讨论  38-39
  2.6 小结  39
  本章参考文献  39-41
第3章 L-MSG对L.brevis NCL912耐酸性的影响及其可能的酸应激反应机制  41-51
  3.1 引言  41
  3.2 材料  41-43
    3.2.1 菌株  41
    3.2.2 培养基  41-42
    3.2.3 主要仪器和设备  42
    3.2.4 主要试剂  42
    3.2.5 主要试剂的配制  42-43
  3.3 方法  43-44
    3.3.1 L.brevis NCL912的培养  43
    3.3.2 L-MSG对L.brevis NCL912生长的影响  43
    3.3.3 比生长速率的计算方法  43
    3.3.4 pH和GABA的测定方法  43
    3.3.5 在pH 2.0条件下,L-MSG对L.brevis NCL912存活的影响  43
    3.3.6 粗酶提取液的制备  43-44
    3.3.7 GAD酶的活性测定  44
    3.3.8 统计学分析  44
  3.4 结果  44-47
    3.4.1 L-MSG对L.brevis NCL912生长和培养基pH变化的影响  44-45
    3.4.2 培养液中GABA的变化  45-46
    3.4.3 在pH 2.0条件下,L-MSG对L.brevis NCL912存活的影响  46-47
    3.4.4 L-MSG对GAD酶活的影响  47
  3.5 讨论  47-48
  3.6 小结  48-49
  本章参考文献  49-51
第4章 L.brevis NCL912在酸胁迫下的差异蛋白表达  51-62
  4.1 引言  51
  4.2 材料  51-53
    4.2.1 菌株  51
    4.2.2 培养基  51
    4.2.3 主要仪器和设备  51-52
    4.2.4 主要试剂  52
    4.2.5 主要溶液的配制  52-53
  4.3 方法  53-56
    4.3.1 L.brevis NCL912差异蛋白质组学研究技术路线  53-54
    4.3.2 L.brevis NCL912破壁处理  54
    4.3.3 L.brevis NCL912全蛋白的提取  54
    4.3.4 丙酮沉淀蛋白质  54
    4.3.5 双向凝胶电泳  54-56
  4.4 结果  56-58
    4.4.1 L.brevis NCL912在pH5.0和4.0条件下的蛋白质浓度  56-57
    4.4.2 L.brevis NCL912在pH5.0和pH4.0条件下的差异蛋白谱图分析  57-58
  4.5 讨论  58-59
    4.5.1 蛋白质破壁方法的确定  58-59
    4.5.2 乳酸菌蛋白质组学研究  59
  4.6 小结  59
  本章参考文献  59-62
第5章 酸胁迫下L.brevis NCL912差异表达蛋白的鉴定及分析  62-72
  5.1 引言  62
  5.2 材料  62-63
    5.2.1 研究对象  62
    5.2.2 主要仪器和设备  62-63
    5.2.3 主要试剂  63
    5.2.4 主要试剂的配制  63
  5.3 方法  63-64
    5.3.1 胶内酶切  63-64
    5.3.2 质谱检测  64
    5.3.3 数据库检索  64
  5.4 结果  64-68
    5.4.1 差异蛋白质点的质谱分析及生物信息学检索  64-68
  5.5 讨论  68-70
    5.5.1 应激蛋白  68
    5.5.2 与蛋白质合成相关的蛋白  68-69
    5.5.3 与DNA合成相关的蛋白  69
    5.5.4 与糖酵解代谢相关的蛋白质  69-70
  5.6 小结  70
  本章参考文献  70-72
第6章 L.brevis NCL912部分差异蛋白的转录学水平验证  72-84
  6.1 引言  72
  6.2 材料  72-73
    6.2.1 菌株  72
    6.2.2 培养基  72-73
    6.2.3 主要仪器和设备  73
    6.2.4 主要试剂  73
  6.3 方法  73-75
    6.3.1 L.brevis NCL912在pH 5.0和4.0条件下总RNA的提取  73-74
    6.3.2 反转录反应与实时荧光定量PCR扩增  74-75
    6.3.3 定量分析方法及统计学分析  75
  6.4 结果  75-79
    6.4.1 L.brevis NCL912在pH 5.0和4.0条件下的总RNA  75
    6.4.2 内参基因荧光定量标准曲线的绘制  75-76
    6.4.3 实时荧光定量PCR结果  76-78
    6.4.4 CBS结构域蛋白和假设蛋白LVIS_0520 mRNA表达的分析及比较  78-79
  6.5 讨论  79-82
    6.5.1 荧光染料的选择  79-81
    6.5.2 数据定量方法的选择  81
    6.5.3 mRNA与蛋白质表达水平不一致的原因分析  81-82
  6.6 小结  82
  本章参考文献  82-84
第7章 添加L-MSG培养基培养的L.brevis NCL912在酸胁迫下的差异蛋白表达  84-102
  7.1 引言  84
  7.2 材料  84-86
    7.2.1 菌株  84
    7.2.2 培养基  84
    7.2.3 主要仪器和设备  84-85
    7.2.4 主要试剂  85-86
    7.2.5 主要溶液的配制  86
  7.3 方法  86-87
    7.3.1 L.brevis NCL912在添加L-MSG培养基中的培养  86
    7.3.2 添加L-MSG培养基培养的L.brevis NCL912酸胁迫下的蛋白质组学研究  86
    7.3.3 部分差异蛋白的转录学水平验证  86-87
    7.3.4 统计学分析方法  87
  7.4 结果  87-96
    7.4.1 添加L-MSG培养基培养的L.brevis NCL912在pH5.0和pH4.0条件下的蛋白质浓度  87
    7.4.2 添加L-MSG培养基培养的L.brevis NCL912在pH5.0和pH4.0条件下的差异蛋白谱图分析  87-89
    7.4.3 差异蛋白质点的质谱分析及生物信息学检索  89-92
    7.4.4 实时荧光定量PCR结果  92-95
    7.4.5 部分差异蛋白mRNA表达水平的分析及比较  95-96
  7.5 讨论  96-99
    7.5.1 酸胁迫诱导的蛋白  96-98
    7.5.2 L-MSG诱导的蛋白  98-99
  7.6 小结  99-100
  本章参考文献  100-102
结论与创新之处  102-104
致谢  104-105
附录一 已鉴定蛋白质的一级质谱图  105-113
攻读学位期间的研究成果  113

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 一般性问题 > 基础科学 > 食品微生物学
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