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云南传统发酵豆豉中乳酸菌多样性及高产γ-氨基丁酸乳酸菌研究

作　者: 龚福明
导　师: 柳陈坚
学　校: 昆明理工大学
专　业: 微生物学
关键词: 传统发酵豆豉 乳酸菌多样性 γ-氨基丁酸 谷氨酸脱羧酶
分类号: TS214.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


在中国,豆豉有着悠久的历史,从古至今豆豉均被视为一种季节性食品或药品而被广泛食用。云南地处中国低纬度的西南高原地区,独特的地理及人文环境造就了云南丰富的豆豉资源。虽然云南传统发酵豆豉资源丰富,但对其微生物多样性及生理活性物质缺乏系统而深入的研究,由此造成该资源未被正确认识与应用。本研究通过传统纯培养技术与分子生物学相结合的方法分析云南传统发酵豆豉中乳酸菌的多样性,并从中筛选出高产Y-氨基丁酸(GABA)的功能性乳酸菌。首先,对云南传统发酵豆豉进行调查与采集,发现云南传统发酵豆豉主要分布在昆明、红河、玉溪、昭通、’文山及迪庆等几大豆豉产区,并逐渐形成以太和豆豉、水豆豉、哈尼豆豉、风吹豆豉、五香豆豉及豆豉条等为代表的传统发酵豆豉。本研究应用富集培养法从30个云南传统发酵豆豉样品中分离了260株产乳酸细菌,根据形态学及生化特性将它们分为12个类群；并对其中的56株代表性菌株进行基于16S rRNA基因序列分析的分子生物学鉴定。鉴定结果表明,上述56株菌分属于6个属14个种,其中的49株菌被鉴定为乳酸菌,鉴定结果如下：Lactobacillus plantarum(10株),L.brevis(2株),L. fermentum(2株),L. alimentarius(1株)；W. confuse(10株),W.paramesenteroides(5株),W. cibaria(1株),Pediococcus acidilactici (7株),P. pentosaceus(5株),Enterococcus faecali s(4株),Staphylococcus simulans(1株)和S. capitis(1株)。另外七株产酸细菌均被鉴定为芽孢杆菌属,分属于Bacillus subtilis和B. cereus两个种其次,应用异硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生紫外检测GABA的高效液相色谱(HPLC)分析法对豆豉由来乳酸菌GABA发酵培养液中的GABA进行定性与定量分析。最终筛选出高产GABA的菌株YM-4-3(产量为5.743mmol/L,即0.5915g/L),分子生物学鉴定的结果表明该菌株属于植物乳杆菌,并将之命名为L. plantarumYM-4-3。进一步的研究表明,该植物乳杆菌具有较强的耐酸及耐胆盐能力,因此该乳酸菌能应用于保健品的研究与开发。再次,探讨L. plantarum YM-4-3由来谷氨酸脱羧酶(GAD)催化谷氨酸钠(MSG)转化为GABA的最适条件。发酵条件对GAD活性影响的研究结果表明,L. plantarumYM-4-3由来GAD活性受氧含量、培养基初始pH、底物浓度、温度等培养条件的影响；而最有利于GAD活性的发酵条件为：pH 6.0,发酵底物MSG的浓度为3%,35℃厌氧发酵96h。此外,GAD酶学性质的研究则表明,L. plantarum YM-4-3由来GAD是一种酸性酶,它催化反应的最适条件为：pH 4.0,磷酸毗哆醛(PLP)浓度200μmol/L,40℃反应40 min。最终,通过对培养基组成和摇瓶培养条件的单因素实验及正交试验,探讨碳氮源组成、培养基初始pH、培养温度、发酵的底物浓度等对L. plantarum YM-4-3发酵生产GABA能力的影响。研究表明,L. plantarum YM-4-3的GABA发酵优化培养基组分为：蛋白胨,15g/L;Lab-lemco’powder,4g/L;酵母浸膏,6g/L；蔗糖,20.0 g/L；Tween-80, 1mL/L;磷酸氢二钾,2.0g/L；醋酸钠,5.0g/L；柠檬酸三铵,2.0g/L；七水硫酸镁,0.2g/L；四水硫酸锰,0.05 g/L。最适的发酵条件为：培养基初始pH 6.0,底物MSG浓度为3%,厌氧条件下35℃静置培养96 h。在此最优的培养条件下,L.plantarum YM-4-3按1%的量接种至20mL优化GABA发酵培养基中,静置培养96h后,发酵液中GABA含量高达16.80mmol/L,比未优化前(5.743mmol/L)增加了近两倍。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
目录  12
插图清单  12-14
附表清单  14-15
英文缩略词表  15-17
第一章 绪论  17
研究动机  17-36
  1.1 传统发酵豆豉微生物的研究现状  18-23
    1.1.1 豆豉简介  18-21
    1.1.2 豆豉由来微生物的概况  21-23
  1.2 乳酸菌与人体健康  23-28
    1.2.1 乳酸菌概述  23
    1.2.2 乳酸菌的微生态调节作用  23-28
  1.3 GABA的研究现状  28-33
    1.3.1 GABA的简介  28-29
    1.3.2 人体内GABA的生理机能  29-31
    1.3.3 GABA的合成方法  31-33
  1.4 豆豉中高产GABA乳酸菌的筛选展望  33
  1.5 豆豉应用的前景与展望  33-34
  1.6 本课题的研究目的、内容和意义  34-35
  1.7 实验路线  35-36
第二章 云南传统发酵豆豉中乳酸菌的分离鉴定及多样性研究  36-52
  2.1 引言  36
  2.2 实验材料  36-39
    2.2.1 实验样品  36-37
    2.2.2 实验仪器  37
    2.2.3 实验用试剂  37-38
    2.2.4 实验用培养基及试剂配制  38-39
  2.3 实验方法  39-42
    2.3.1 云南传统发酵豆豉样品的调查与采集  39
    2.3.2 云南传统发酵豆豉样品中乳酸菌的分离  39-40
    2.3.3 产酸细菌的生化试验  40
    2.3.4 产酸微生物的分子生物学鉴定  40-42
    2.3.5 云南省传统发酵豆豉中乳酸菌的多样性分析  42
  2.4 结果  42-45
    2.4.1 云南传统发酵豆豉的分布及概况  42
    2.4.2 改良MRS琼脂培养基的菌落计数及产酸菌株的分离  42-45
    2.4.3 豆豉由来乳酸菌的生化鉴定及基于16S rRNA基因的分子生物学鉴定  45
    2.4.4 豆豉中乳酸菌多样性分析  45
  2.5 讨论  45-51
  2.6 本章小结  51-52
第三章 云南传统发酵豆豉中产GABA乳酸菌的筛选  52-63
  3.1 引言  52
  3.2 实验材料  52-54
    3.2.1 实验菌株  53
    3.2.2 实验仪器  53
    3.2.3 实验用试剂  53-54
    3.2.4 实验用培养基及试剂配制  54
  3.3 实验方法  54-56
    3.3.1 豆豉中乳酸菌的GABA发酵及GABA的粗提  54-55
    3.3.2 GABA的HPLC分析  55-56
    3.3.3 高产GABA乳酸菌的耐酸及耐胆盐实验  56
  3.4 结果  56-60
    3.4.1 色谱行为  56-57
    3.4.2 HPLC对GABA定性及定量方法的建立  57-59
    3.4.3 豆豉中高产GABA乳酸菌的筛选  59
    3.4.4 高产GABA的菌株Lactobacillus plantarum YM-4-3耐酸和耐胆盐实验  59-60
  3.5 讨论  60-61
  3.6 本章小结  61-63
第四章 植物乳杆菌YM-4-3由来GAD的发酵条件及其酶学性质初探  63-76
  4.1 引言  63
  4.2 实验材料  63-65
    4.2.1 实验菌株  63
    4.2.2 实验仪器  63-64
    4.2.3 实验用试剂  64
    4.2.4 实验用培养基及试剂配制  64-65
  4.3 实验方法  65-68
    4.3.1 GAD粗酶液的制备  65-66
    4.3.2 GAD粗酶活力的测定  66
    4.3.3 L.plantarum YM-4-3菌体生长量的测定  66
    4.3.4 培养条件对L.plantarum YM-4-3由来GAD活力的影响  66-67
    4.3.5 不同条件对L.plantarum YM-4-3 GAD活性的影响  67-68
  4.4 结果  68-74
    4.4.1 培养条件对L plantarum YM-4-3 GAD活性影响的结果  68-71
    4.4.2 不同条件对L.plantarum YM-4-3 GAD活性的影响结果  71-74
  4.5 讨论  74
  4.6 本章小结  74-76
第五章 高产GABA植物乳杆菌YM-4-3摇瓶发酵条件的优化  76-89
  5.1 引言  76
  5.2 实验材料  76-78
    5.2.1 实验菌株  76
    5.2.2 实验仪器  76-77
    5.2.3 实验用试剂  77
    5.2.4 实验用培养基、碳氮源及试剂配制  77-78
  5.3 实验方法  78-80
    5.3.1 L.plantarum YM-4-3菌种的复壮及其生长曲线的绘制  78
    5.3.2 菌株L.plantarum YM-4-3的GABA发酵培养基组成优化  78-79
    5.3.3 L.plantarum YM-4-3发酵生产GABA条件的优化  79
    5.3.4 其他因素对L.plantarum YM-4-3 GABA合成量的影响  79-80
  5.4 结果与讨论  80-87
    5.4.1 L.plantarum YM-4-3菌株的生长曲线  80-81
    5.4.2 培养基组成的优化  81-83
    5.4.3 发酵条件的优化  83-86
    5.4.4 其他因素对L.plantarum YM-4-3 GABA生物合成的影响  86-87
  5.5 本章小结  87-89
第六章 总结  89-92
  6.1 掌握云南传统发酵豆豉的分布概况,建立云南传统发酵豆豉中乳酸菌的分离和鉴定方法  89
  6.2 应用分子生物学与HPLC分析技术相结合的方法,建立豆豉中高产GABA乳酸菌的筛选体系  89-90
  6.3 探讨高产GABA植物乳杆菌(YM-4-3)的发酵特性及其酶学性质  90
  6.4 应用展望  90-92
致谢  92-93
参考文献  93-102
附录A 攻读硕士期间发表论文目录  102-103
附录B 其他需要说明的内容  103-105

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 粮食加工工业 > 豆类制食品 > 大豆制食品
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