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吗啡引起伏隔核抗坏血酸释放的作用机制研究

作　者: 孙吉叶
导　师: 吴春福
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 药理学
关键词: 吗啡 伏隔核 前额叶皮层 海人藻酸 抗坏血酸 谷氨酸 γ-氨基丁酸 脑微透析 Na~+依赖的抗坏血酸转运体2
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


吗啡(morphine)对中枢神经系统产生广泛而复杂的作用。抗坏血酸(ascorbic acid, AA)具有抗氧化以及酶的辅助因子等多种作用,并且在中枢神经系统中发挥着重要的神经调质作用。调节AA的释放可能是成瘾性药物的共同特征。我们研究发现大鼠伏隔核(nucleus accumbens, NAc)透析给予吗啡与全身给予吗啡时引起NAc内AA释放的结果不同,提示不同方式给予吗啡引起NAc中AA的释放存在不同的调节机制。基于此,本文从神经生化、行为学和分子生物学等多个水平研究吗啡引起NAc内AA释放的作用机制,以期为吗啡中枢作用机制研究提供理论依据。首先采用脑微透析结合高效液相色谱-电化学检测和高效液相色谱-荧光检测方法考察了局部NAc透析给予吗啡引起NAc内AA、谷氨酸(glutamate, Glu)、γ-氨基丁酸(γ-aminubutiric acid, GABA)释放的影响。随之考察阿片受体拮抗剂纳洛酮对吗啡作用的影响。结果表明,吗啡(100μM,1mM)能够剂量依赖性地增加NAc内AA和GABA的释放,降低Glu的释放。给予纳洛酮能够显著抑制吗啡引起NAc内AA释放的增加,同时能够抑制吗啡引起的GABA释放的升高,但不影响吗啡引起的Glu的降低。提示吗啡至少是部分通过作用于阿片受体,尤其是NAc内p受体,而产生的对AA和GABA释放的一系列作用。进一步采用海人藻酸(kainic acid, KA)损毁NAc考察其对吗啡作用的影响。结果表明,NAc损毁抑制了吗啡引起NAc内AA和GABA释放的增加,但不影响吗啡引起的Glu释放降低。提示,KA损毁可能导致了NAc内主要的GABA神经元的缺失从而产生一系列效应。为了验证上述推测,又采用NAc局部注射GABAA受体激动剂muscimol考察其对NAc损毁后吗啡作用的影响。结果表明,muscimol能够逆转KA损毁NAc引起的吗啡对AA和GABA释放的抑制作用,提示NAc内GABA能系统在一定程度上参与了吗啡引起的NAc内AA的释放。此外,采用KA损毁NAc的方法,考察其在影响吗啡引起生化水平改变的同时,是否会对吗啡引起的行为学改变产生影响。结果表明,KA损毁NAc能够增加单次吗啡引起的大鼠水平和垂直运动次数；能够部分地阻断大鼠急性成瘾时的戒断症状；强化吗啡对小鼠的镇痛作用；不影响吗啡诱导的小鼠行为敏化的形成,但能阻断吗啡诱导的小鼠行为敏化表达。提示NAc作为中脑边缘重要核团,在吗啡引起的相关行为学中发挥着重要作用。NAc接受来自其他脑区的神经投射。本文进一步考察了前额叶皮层Glu能系统和腹侧被盖区(ventral tegmental area, VTA)对伏隔核的神经投射对吗啡引起AA释放的影响。结果表明,前额叶皮层-NAc的Glu能神经投射降低NAc内的Glu基础释放,不影响GABA基础释放,进一步确证了前额叶皮层-NAc的谷氨酸能神经投射不是参与吗啡作用的主要因素。VTA内注射GABAA受体拮抗剂bicuculine和激动剂muscimol影响NAc中AA的基础释放,muscimol不影响吗啡的作用,但bicuculine能够拮抗吗啡引起的NAc中AA和GABA释放的增加；同时,VTA内注射bicuculine显著升高多巴胺(dopamine, DA)的基础释放,降低NAc中GABA的基础释放,而muscimol作用与之相反。提示VTA到NAc的神经投射可能参与了吗啡引起的NAc中AA释放过程。已知脑内AA主要是通过Na+依赖的AA转运体(SVCT2)转运入脑和神经元从而发挥作用的,并且能够逆浓度梯度在细胞内聚集AA。本文进一步采用RT-PCR、Western blot的方法,考察了上述研究过程中吗啡对脑内AA转运体表达的影响。结果表明,全身给予吗啡能够剂量依赖性地增加纹状体中SVCT2 mRNA和蛋白的表达；NAc透析给予吗啡能够增加NAc内SVCT2 mRNA和蛋白的表达；NAc给予纳洛酮和VTA给予bicuculine能够拮抗吗啡引起的NAc中SVCT2 mRNA和蛋白表达的增加。提示,在吗啡通过作用于受体及神经系统等引起NAc内AA水平改变的过程中,SVCT2可能发挥着重要作用。综上,NAc内的GABA能神经系统参与了吗啡引起的NAc中AA的释放；KA损毁NAc不但改变吗啡的神经生化水平作用,还影响吗啡镇痛和行为敏化的行为学作用；前额叶皮层-NAc的Glu能神经通路在吗啡引起NAc内AA释放过程中可能不发挥主要作用,而VTA-NAc的DA能神经通路参与了吗啡的作用。在吗啡引起AA释放的同时,对SVCT2的表达也产生影响。上述研究不仅有助于深入了解吗啡对NAc内AA释放的调节机理,同时也为进一步了解吗啡中枢作用提供依据。

全文目录


摘要  12-14
ABSTRACT  14-17
前言  17-32
  1 阿片类物质  17-18
  2 吗啡  18-21
  3 抗坏血酸  21-27
  4 NAc、VTA在脑中的作用  27-28
  5 AA转运体在脑内发挥的作用  28-32
第一部分 纳洛酮对吗啡引起伏隔核抗坏血酸释放的影响  32-47
  前言  32-34
  实验材料  34-35
  实验方法  35-39
    1. 脑微透析手术方法  35-36
    2. 脑微透析灌流方法  36
    3. 抗坏血酸(AA)含量的测定  36-37
    4. 谷氨酸(Glu)和GABA含量的测定  37-38
    5. 局部伏隔核透析给予吗啡对伏隔核内AA,Glu和GABA释放的影响  38
    6. 纳洛酮对局部伏隔核透析给予吗啡对伏隔核内AA,Glu和GABA释放的影响  38-39
    7. 组织学检查  39
    8. 统计学处理  39
  实验结果  39-45
    1. AA,Glu和GABA线性关系  39-40
    2. 大鼠伏隔核AA,Glu和GABA的基础水平  40
    3. 局部伏隔核透析给予吗啡对伏隔核内AA,Glu和GABA释放的影响  40-42
    4. 全身和局部伏隔核给予纳洛酮对吗啡引起伏隔核AA释放的影响  42-43
    5. 全身和局部伏隔核给予纳洛酮对吗啡引起伏隔核Glu释放的影响  43-44
    6. 全身和局部伏隔核给予纳洛酮对吗啡引起伏隔核GABA释放的影响  44-45
  讨论  45-46
  小结  46-47
第二部分 海人藻酸(KA)损毁伏隔核对吗啡引起抗坏血酸释放的影响  47-62
  前言  47-48
  实验材料  48-49
  实验方法  49-50
    1. 大鼠伏隔核KA损毁方法  49
    2. Nissle染色方法  49-50
    3. 实验分组及给药方法  50
    4. 统计学处理  50
  实验结果  50-58
    1. KA损毁伏隔核的组织学检查  50-52
    2. KA损毁伏隔核对吗啡引起伏隔核中AA释放的影响  52-54
    3. KA损毁伏隔核对吗啡引起伏隔核中Glu释放的影响  54-55
    4. KA损毁伏隔核对吗啡引起伏隔核中GABA释放的影响  55-57
    5. GABAA受体激动剂muscimol对KA损毁后,对吗啡作用的影响  57-58
  讨论  58-61
  小结  61-62
第三部分 KA损毁伏隔核对吗啡引起的行为学改变的影响  62-78
  前言  62-64
  实验材料  64-65
  实验方法  65-67
    1. KA损毁伏隔核  65
    2. KA损毁伏隔核对急性给予吗啡引起大鼠成瘾及戒断的影响  65
    3. KA损毁伏隔核对吗啡引起大鼠自主活动变化的影响  65-66
    4. KA损毁伏隔核对小鼠吗啡镇痛作用的影响  66
    5. KA损毁伏隔核对小鼠行为敏化形成和表达的影响  66
    6. 统计学处理  66-67
  实验结果  67-74
    1. KA损毁伏隔核对吗啡引起大鼠自主活动变化的影响  67-68
    2. KA损毁伏隔核对吗啡急性成瘾后戒断症状的影响  68-69
    3. KA损毁伏隔核对小鼠吗啡镇痛作用的影响  69-71
    4. KA损毁伏隔核对小鼠行为敏化形成和表达的影响  71-74
  讨论  74-77
  小结  77-78
第四部分 前额叶皮层-伏隔核、VTA-伏隔核神经通路对吗啡引起伏隔核AA释放的影响  78-93
  前言  78-79
  实验材料  79-80
  实验方法  80-82
    1. 大鼠去前额叶皮层方法  80-81
    2. VTA给药管埋置方法  81
    3. 给药方法  81
    4. 多巴胺含量的测定  81
    5. 统计学处理  81-82
  实验结果  82-89
    1. 去前额叶皮层对伏隔核中Glu,GABA释放的影响  82-83
    2. VTA中GABA_A受体对吗啡引起伏隔核中AA释放的调节  83-85
    3. VTA中GABA_A受体对吗啡引起伏隔核中Glu释放的调节  85-86
    4. VTA中GABA_A受体对吗啡引起伏隔核中GABA释放的调节  86-88
    5. VTA中GABA_A受体对伏隔核中DA释放的调节  88-89
  讨论  89-92
  小结  92-93
第五部分 吗啡对抗坏血酸转运体表达的影响  93-113
  前言  93-94
  实验材料  94-96
  实验方法  96-102
    1. RT-PCR实验方法  96-99
    2. Western blot analysis(免疫印迹法)  99-101
    3. 实验设计  101-102
    4. 统计学处理  102
  实验结果  102-109
    1. 腹腔注射吗啡对纹状体中SVCT1和SVCT2 mRNA表达水平的影响  102-103
    2. 腹腔注射和局部伏隔核透析给予吗啡后对伏隔核中SVCT1和SVCT #2mRNA表达水平的影响  103-104
    3. 纳洛酮对吗啡引起伏隔核中SVCT1和SVCT2 mRNA表达水平改变的影响  104
    4. GABAA受体激动剂和拮抗剂对吗啡引起伏隔核中SVCT1和SVCT2 mRNA表达水平改变的影响  104-105
    5. 腹腔注射吗啡对纹状体中SVCT2蛋白表达水平改变的影响  105-106
    6. 腹腔注射和局部伏隔核透析给予吗啡对伏隔核中SVCT2蛋白表达水平改变的影响  106-107
    7. 纳洛酮对吗啡引起伏隔核中SVCT2蛋白表达水平改变的影响  107-108
    8. GABAA受体激动剂和拮抗剂对吗啡引起伏隔核中SVCT2蛋白表达水平改变的影响  108-109
  讨论  109-112
  小结  112-113
结论  113-114
参考文献  114-137
致谢  137-138
缩略词表  138-139
发表文章  139-140
个人简历  140-141
英文译文  141-151
附件  151

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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