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狂犬病病毒定量检测方法的建立

作　者: 王远征
导　师: 张国强
学　校: 北京生物制品研究所
专　业: 病原生物学
关键词: 狂犬病狂犬病疫苗 NIH法多克隆抗体 ELISA
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

狂犬病是一种严重危害人类健康的人畜共患病,且尚无有效的治疗方法,患者一旦发病,死亡率100%。目前,接种疫苗是防治该病的有效措施。因此,狂犬病疫苗的效力对人群的保护起着关键性作用。在狂犬病疫苗生产中,评价疫苗效力一直沿用《狂犬病实验室技术》中介绍的美国国立卫生研究院的方法,简称NIH法。由于该方法需要经过动物免疫、攻毒等试验程序,因此检测周期长,在生产研究工作的应用中受到一定限制。为此近年来国内外学者相继建立了一系列体外实验,用于狂犬病病毒的检测,如抗体结合实验,单向琼脂免疫扩散试验(SRDsingle-radial-immunodiffusion),酶联免疫吸附试验(ELISA enzymeimmunoassay)等。ELISA是众多方法中发展较为成熟的一种。目前,FDA在检测Chiron和Aventis狂犬疫苗的效力时,均使用ELISA。2003年,WHO关于人用狂犬病疫苗效力要求讨论报告中指出,体外试验有望代替NIH试验。本课题的研究内容是,应用酶联免疫技术建立狂犬病病毒体外检测方法。试验中采用狂犬病病毒aG株,在豚鼠脑组织中连续传三代制备病毒抗原,免疫豚鼠后获得了高效价的特异性抗血清,经盐析法获得纯化多克隆抗体。用此抗体分别包被酶联反应板和标记辣根过氧化物酶,建立双抗体夹心检测法。用中国药品生物制品检定所制备的狂犬病疫苗国家参考品(6.7IU/ml)经系列稀释后,建立剂量反应曲线,并以此作为检测方法的质控参比品。经初步验证,该方法能特异地检测不同来源样品中狂犬病病毒,与其它病毒无交叉反应。疫苗制备中的基质蛋白及赋型剂等成份,对检测系统均无影响。该检测方法不仅可以定性,同样可以精确定量。剂量反应曲线表明,方法的最佳定量范围在10—110 mIU/ml,相关系数r=0.9913±0.00510(95%可信区间,n=20,S=0.135,Sx=0.030)。最低检出限度为5.3 mIU/ml。适用性验证表明,该方法可准确监测狂犬病病毒在细胞传代过程中增殖情况;可对狂犬病疫苗半成品中的病毒抗原含量进行即时检测;此外,以国家参考品的标识效价(6.7IU/ml)为定量依据,采用平行线法对市场上销售的不同厂家的狂犬疫苗进行测定,其效价在2.3—9.4IU/ml之间,除个别样品外,均超过狂犬病疫苗效力要求的标准2.5IU/剂。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
前言  7-8
实验技术路线  8-11
实验材料及仪器  11-14
  一主要仪器设备  11-12
  二主要试剂及实验动物  12-14
第一部分狂犬病抗体的制备  14-20
  1 实验方法  14-16
  2 实验结果  16-20
第二部分双抗体夹心酶联免疫方法的建立  20-29
  1 实验方法  20-22
  2 实验结果  22-29
第三部分方法初步验证及应用  29-41
  1 实验方法  29-31
  2 实验结果  31-41
讨论  41-44
  一.抗体的制备  41-43
  二.单克隆抗体与多克隆抗体在实际应用中的差异分析  43-44
结论  44-46
参考文献  46-47
综述: 狂犬病病毒抗原的体外检测方法分析  47-56
致谢  56-57

狂犬病病毒定量检测方法的建立

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