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异源强毒株HN基因替换对嵌合体新城疫rLaSota病毒致病力影响的研究

作　者: 丁玉林
导　师: 王凤龙；步志高
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶 LaSota疫苗株反向遗传 F48E9 HB38
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

新城疫(Newcastle disease,ND)是危害世界养禽业的重大烈性传染病。由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起,NDV为单股负链RNA病毒,属于副黏病毒科( Paramyxoviridae)、禽副黏病毒属(Avulavirus)。NDV基因组全长15kb,其基因组编码的蛋白包括核蛋白(nucleoprotein.NP),磷蛋白(phosphoprotein,P),基质蛋白(matrix protein,M),融合蛋白(fusion proteins,F),血凝素-神经氨酸酶蛋白(hemagglutinin- neuraminidase,HN)和大聚合酶蛋白(RNA-dependent RNA polymerase or large polymerase,L)六个独立转录编码单元。人们对新城疫病毒致病性的研究主要集中在F蛋白和HN蛋白的致病力上,认为F蛋白的裂解位点的氨基酸序列是新城疫病毒致病性的主要决定因素。NDV的HN蛋白是一个多功能蛋白,NDV的HN基因在病毒的感染过程中扮演着重要角色,但是HN基因对致病性的确切作用还不十分明确。HN蛋白具有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种活性。识别细胞表面的唾液酸的受体并促进F蛋白的融合作用。因此,HN蛋白在病毒的感染过程中扮演着重要的角色。本研究在成功重组新城疫Lasota的基础上,利用反向遗传操作技术,将强毒株F48E9、HB38的HN基因替换rLasota的HN基因。提取F48E9、HB38基因组RNA,利用引物经RT-PCR获得其HN基因的PCR产物。连接pBluscriptⅡKS(+/-)载体多克隆位点上,测序正确后,利用特定的MunⅠ和SpeⅠ酶切位点酶切得HN基因片段。构建全长质粒,进行转染,收获病毒rL-F48E9HN、rL-HB38HN。拯救病毒rL-F48E9HN、rL-HB38HN的F3代,收获病毒阳性尿囊液提取病毒基因组RNA,进行RT-PCR及序列分析。嵌合病毒rL-F48E9HN、rL-HB38HN在鸡胚内的生长特性与亲本株Lasota一致,与F48E9、HB38的生长特性相差甚远。通过分析是否HN蛋白的来源对于NDV的生物学活性有一定的影响,以及亲本毒株及嵌合病毒红细胞吸附性和融合作用。结果表明:嵌合病毒红细胞吸附性明显增强,rL-F48E9HN、rL-HB38HN分别增加51%、62%,而融合作用无明显变化。嵌合病毒对鸡及鸡胚的致病性研究表明:rL-F48E9HN、rL-HB38HN的MDT分别为148h、120h,ICPI分别为0.43、0.64;IVPI均为0。说明嵌合病毒rL- F48E9HN、rL- HB38HN的致病指标有微弱的增强,但是并没有达到强毒力水平,仍属于弱毒株。结果也表明NDV的致病性是多基因作用的结果,F蛋白的裂解位点并不是NDV毒力的唯一决定因素。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
引言  9-26
  1 新城疫  9-10
  2 新城疫病毒  10-25
    2.1 NDV 生物学特性  10-13
      2.1.1 NDV 的结构及形态特性  10-11
      2.1.2 血凝特性  11
      2.1.3 神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）  11
      2.1.4 细胞融合与溶血活性  11-12
      2.1.5 抗肿瘤和抗衰老  12
      2.1.6 病原性  12
      2.1.7 NDV 抗原性  12
      2.1.8 NDV 的复制  12-13
    2.2 NDV 基因组结构及其功能  13-14
    2.3 NDV 结构蛋白及功能  14-19
      2.3.1 核衣壳蛋白  14
      2.3.2 磷蛋白  14-15
      2.3.3 基质蛋白  15-16
      2.3.4 融合蛋白  16-17
      2.3.5 血凝素-神经氨酸酶  17-18
      2.3.6 RNA 依赖性 RNA 聚合酶  18-19
    2.4 NDV 致病性的分子基础  19-21
    2.5 NDV 病毒的分离与鉴定  21
    2.6 新城疫病毒的反向遗传操作系统的发展  21-25
  3 本实验研究的目的及意义  25-26
实验部分  26-48
  1 材料与方法  26-34
    1.1 质粒、菌种、细胞和病毒  26
    1.2 SPF 鸡和 SPF 鸡胚  26
    1.3 主要试剂与材料  26-27
    1.4 嵌合病毒全长cDNA 的构建  27-29
      1.4.1 引物设计与合成  27
      1.4.2 F48E9 和 HB38 病毒 RNA 提取、反转录及 PCR 扩增  27-29
      1.4.3 F48E9 和 HB38HN 基因替换过程  29
    1.5 病毒的拯救  29-30
    1.6 拯救病毒的基因序列分析确认  30
    1.7 各嵌合病毒在 SPF 鸡胚的生长特性  30-31
    1.8 红细胞吸附实验  31-32
    1.9 嵌合体病毒融合指数检测  32
    1.10 各拯救病毒的致病性试验  32-33
      1.10.1 各嵌合病毒鸡胚平均致死时间（MDT）的测定  32-33
      1.10.2 各嵌合病毒1 日龄鸡脑内致病指数（ICPI）测定  33
      1.10.3 各嵌合病毒6 周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)的测定  33
    1.11 交叉免疫保护实验  33-34
  2 结果  34-44
    2.1 嵌合病毒获得  34-36
    2.2 嵌合病毒的生长特性  36
    2.3 嵌合病毒生物学活性  36-39
      2.3.1 嵌合病的红细胞吸附性（HAd）  37
      2.3.2 嵌合病毒的细胞融合活性  37-39
    2.4 嵌合病毒的致病性  39-44
      2.4.1 嵌合病毒的细胞致病性  39-42
      2.4.2 嵌合病毒对鸡胚和雏鸡的致病力测定  42-44
    2.5 交叉免疫保护实验结果  44
  3 讨论  44-47
    3.1 序列分析  45
    3.2 嵌合病毒的分子生物学分析  45-46
    3.3 嵌合病毒的致病性分析  46-47
    3.4 单因子血清交叉免疫保护实验分析  47
  4 结论  47-48
致谢  48-49
参考文献  49-61
附录  61-67
作者简介  67

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