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新城疫F48E9毒株与Lasota毒株感染鸡后外周血部分细胞因子差异表达的研究

作　者: 刘温泉
导　师: 黄勇
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 新城疫病毒F48E9毒株新城疫病毒Lasota毒株外周血细胞因子 Real-time PCR
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

新城疫病毒是危害世界养禽业最主要的病毒之一,新城疫病毒的危害性因毒株的不同而呈现出一定的差异。外周血是新城疫病毒在机体内传播重要的载体,同时外周血淋巴细胞也通过表达细胞因子控制病毒在体内的传播。为了解新城疫病毒强毒株与弱毒株在外周血中的载量变化规律以及不同毒力的新城疫病毒感染所引起的外周血淋巴细胞中细胞因子的差异表达状况,在本研究中,使用了新城疫病毒强毒株F48E9株与弱毒株Lasota株分别感染SPF成年鸡,同时使用一组未感染病毒的成年鸡作对照。在感染后0天、3天、7天、10天、14天、21天这6个时间点分别采集三组成年鸡的外周血,进行外周血总RNA的提取并且反转录,最后使用Real-time PCR技术对IFN alpha、IFN gamma、IL-2、IL-6、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18这9种细胞因子mRNA以及新城疫病毒F48E9毒株与Lasota毒株在外周血中的载量进行检测。实验结果表明,新城疫病毒F48E9株在外周血中的载量在感染病毒后迅速升高,在感染后7天达到峰值,拷贝数为8.56×106copies/mL,而后又迅速下降。与之相比,新城疫病毒Lasota株在外周血中的载量在感染后上升缓慢,于感染后10天达到峰值,拷贝数为6.60×106copies/mL,之后在外周血中的载量缓慢下降。两毒株相比,F48E9株的峰值高于Lasota株的峰值,且F48E9株峰值出现早于Lasota株峰值出现时间。在细胞因子表达检测方面,无论新城疫病毒F48E9株还是新城疫病毒Lasota株均能够引起IFN-γ在感染后的高效的表达,且其各自峰值与对照组相比呈现显著差异；新城疫病毒F48E9毒株与新城疫病毒Lasota毒株相比,更能够迅速的诱导外周血淋巴细胞当中IFN-α与IFN-γ表达,且F48E9毒株与Lasota毒株相比F48E9诱导IFN-α表达的能力更强,而Lasota株诱导IFN-γ表达的能力更强。IL-2的mRNA的表达情况有所不同,仅Lasota株能够诱导其高效表达且其峰值与对照组相比呈现显著差异,而F48E9株对IL-2的诱导效应不明显；与之相反,IL-10、IL-16、IL-18这三种细胞因子仅F48E9株能够诱导高效表达且其峰值与对照组相比呈现显著差异。同时在研究中还发现无论是F48E9株还是Lasota株均能够诱导IL-13的高效表达,而二者对IL-15表达诱导的峰值与对照组相比无显著差异。在实验中还发现在感染了新城疫病毒的成年鸡外周血中各个时间点均不能检测到IL-6的mRNA表达,而在各个时间点的对照组成年鸡外周血中却能够检测到IL-6的mRNA表达。实验证明,F48E9在外周血中载量的变化呈现上升迅速而下降迅速的趋势,而Lasota在在外周血中载量的变化呈现上升缓慢而下降迅速的趋势,F48E9毒株感染的成年鸡在外周血中载量的峰值时间先于并高于Lasota毒株感染的成年鸡。在新城疫病毒感染过程当中,各个细胞因子的表达在F48E9毒株与Lasota毒株之间存在一定的差异,可能与感染病毒的毒力以及外周血中病毒载量变化存在一定的关系。

全文目录

中文摘要  7-9
Abstract  9-11
英文缩略词表  11-13
1. 文献综述  13-31
  1.1 新城疫病毒的概述  13-21
    1.1.1 新城疫病毒的历史与分类地位  13-14
    1.1.2 新城疫病毒的一般特性  14-16
    1.1.3 新城疫病毒的分子生物学特性  16-17
    1.1.4 新城疫病毒致病的分子基础  17-19
    1.1.5 新城疫病毒的检测与诊断  19
    1.1.6 新城疫病毒的分子流行病学  19-21
  1.2 家禽细胞因子研究进展  21-26
  1.3 实时荧光定量PCR  26-29
    1.3.1 Real-time PCR的原理  26-28
    1.3.2 几类常见的Real-time PCR技术  28-29
  1.4 选题目的与意义  29-31
2. 材料与方法  31-42
  2.1 实验材料与实验仪器  31-34
    2.1.1 实验动物、病毒、菌株  31
    2.1.2 主要实验仪器  31-32
    2.1.3 主要购买试剂及其它配制试剂  32-34
  2.2 实验方法  34-42
    2.2.1 新城疫病毒F48E9毒株EID50的测定  34
    2.2.2 Real-time PCR引物的设计  34-35
    2.2.3 质粒标准品的构建  35-38
      2.2.3.1 细胞因子与NDV基因的PCR扩增  35
      2.2.3.2 细胞因子与NDV基因的PCR产物的胶回收  35-36
      2.2.3.3 感受态细胞的制作  36
      2.2.3.4 PCR产物的克隆与转化  36-37
      2.2.3.5 重组质粒的筛选与鉴定  37-38
      2.2.3.6 细胞因子基因的DNA序列测定  38
    2.2.4 Real-time PCR条件的优化  38
    2.2.5 标准曲线的生成  38-39
      2.2.5.1 Real-time PCR标准品目的DNA模板浓度的测定  38
      2.2.5.2 Real-time PCR标准品的稀释与标准曲线的生成  38-39
    2.2.6 动物感染NDV与样品的采集  39
      2.2.6.1 动物的分组与NDV抗体的测定  39
      2.2.6.2 实验动物感染NDV  39
      2.2.6.3 实验动物外周血的采集  39
    2.2.7 RNA的提取与反转录  39-41
      2.2.7.1 RNA的提取  39-40
      2.2.7.2 RNA质量的抽查  40
      2.2.7.3 反转录反应  40-41
    2.2.8 Real-time PCR反应  41
    2.2.9 数据的处理与统计  41-42
3. 结果  42-65
  3.1 新城疫病毒F48E9毒株ELD50的测定值  42
  3.2 普通PCR电泳条带  42-43
  3.3 重组质粒的鉴定  43-44
  3.4 测序结果与同源性的比较  44
  3.5 质粒标准品OD260的测定  44-45
  3.6 Real-time PCR条件优化结果  45
  3.7 Real-time PCR标准曲线  45-52
    3.7.1 Beta-actin标准曲线的制作  45-46
    3.7.2 IFN alpha标准曲线的制作  46-47
    3.7.3 IFN gamma标准曲线的制作  47
    3.7.4 IL-2标准曲线的制作  47-48
    3.7.5 IL-6标准曲线的制作  48
    3.7.6 IL-10标准曲线的制作  48-49
    3.7.7 IL-13标准曲线的制作  49-50
    3.7.8 IL-15标准曲线的制作  50
    3.7.9 IL-16标准曲线的制作  50-51
    3.7.10 IL-18标准曲线的制作  51
    3.7.11 NDV标准曲线的制作  51-52
  3.8 Real-time PCR结果  52-65
    3.8.1 NDV在外周血的载量变化规律  52-53
    3.8.2 细胞因子的差异表达状况  53-65
      3.8.2.1 IFN alpha的差异表达状况  53-55
      3.8.2.2 IFN gamma的差异表达状况  55-56
      3.8.2.3 IL-2的差异表达状况  56-58
      3.8.2.4 IL-6的差异表达状况  58
      3.8.2.5 IL-10的差异表达状况  58-59
      3.8.2.6 IL-13的差异表达状况  59-61
      3.8.2.7 IL-15的差异表达状况  61-62
      3.8.2.8 IL-16的差异表达状况  62-63
      3.8.2.9 IL-18的差异表达状况  63-65
4. 讨论  65-70
  4.1 外周血中新城疫病毒Real-time PCR检测方法的建立  65
  4.2 NDV不同毒株在外周血中载量的变化规律  65-66
    4.2.1 F48E9毒株在外周血中载量的变化规律  65
    4.2.2 Lasota毒株在外周血中载量的变化规律  65-66
    4.2.3 F48E9毒株与Lasota毒株在外周血中载量的变化规律的差异  66
  4.3 成年鸡感染NDV后外周血细胞中细胞因子的差异表达  66-70
    4.3.1 IFN alpha基因的差异表达  66-67
    4.3.2 IFN gamma基因的差异表达  67
    4.3.3 IL-2与IL-15基因的差异表达  67-68
    4.3.4 IL-6基因的差异表达  68
    4.3.5 IL-10基因的差异表达  68
    4.3.6 IL-13基因的差异表达  68
    4.3.7 IL-16与IL-18基因的差异表达  68-70
5. 参考文献  70-79
6. 致谢  79

新城疫F48E9毒株与Lasota毒株感染鸡后外周血部分细胞因子差异表达的研究

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