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仙人掌多糖的提取、体外抗鸡新城疫病毒作用及其对鸡十二指肠、空肠肠黏膜免疫的影响

作　者: 宛燕飞
导　师: 李英伦
学　校: 四川农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 仙人掌多糖 提取工艺 鸡新城疫病毒 肠黏膜免疫
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本研究目的是确定从单刺仙人掌中提取多糖的最佳工艺,研究仙人掌多糖(Opuntia monacantha polysaccharides, OMPS)对鸡新城疫病毒的体外抑制作用,并初步探讨其作用机理以及研究仙人掌多糖对免疫鸡十二指肠、空肠肠黏膜免疫的影响。试验方法与结果如下：1.通过单因素考察和正交设计试验确定了仙人掌多糖“水提醇沉法”最佳提取工艺为：提取温度为100℃,提取时间为3h,料液比为1：8,乙醇沉淀浓度为70%。在此工艺下仙人掌多糖的含量为38.6%,提取率为0.58%,蛋白质含量为0.037%。2.通过三种不同的给药方式,即先加仙人掌多糖后攻鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)、仙人掌多糖和病毒同时加入以及先攻毒后加仙人掌多糖,用MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide)法在450nm测定细胞吸光度值,以病毒抑制率、半数治疗浓度、治疗指数为指标,评价仙人掌多糖对鸡新城疫病毒感染能力的影响。结果表明,三种不同的给药方式对鸡新城疫病毒都有一定的抑制作用。其中先加仙人掌多糖后攻毒组病毒抑制率最高,其次是仙人掌多糖和病毒同时加入组,最后为先攻毒后加仙人掌多糖组,结果表明仙人掌多糖具有明显抑制NDV的作用,特别是先加仙人掌多糖后攻毒效果最优,且有一定的量效关系,提示临床以预防给药为主。3.雏鸡滴眼、滴鼻免疫鸡新城疫活疫苗后,灌服不同剂量的仙人掌多糖,结果显示免疫后第一周时抗体效价均显著提高。免疫后第二周时抗体效价均达到最高值,随后下降。仙人掌多糖高剂量组(160m/ml.kg)与生理盐水组比较,在免疫后第二周到第四周,均能极其显著提高抗体水平(P<0.01)。中剂量组(80mg/ml.kg)与生理盐水组比较,在免疫后第二周差异极其显著(P<0.01),在免疫后第三周、第四周差异显著(P<0.01)。表明仙人掌多糖可显著提高鸡新城疫VI系苗的免疫效果,且有一定的量效关系,在实际生产中可作为免疫增强剂使用。4.在对雏鸡滴鼻免疫的同时,灌服不同剂量的仙人掌多糖,用ELISA方法检测肠黏液中SIgA的含量,并用免疫组织化学方法分别检测十二指肠和空肠中阳性细胞和阳性物质。(1)ELISA方法检测肠黏液中SIgA (secretary immunoglobulin A)的含量结果仙人掌多糖高、中剂量组能明显提高肠黏液中SIgA的含量,且呈现一定的剂量关系。免疫后第二周,高剂量组(160mg/mL.kg)与中剂量组(80mg/mL.kg)、低剂量组(40mg/mL.kg)与生理盐水组,差异均极其显著(P<0.01),中剂量组与低剂量组差异显著(P<0.05)。免疫后第三周和第四周,高剂量组与低剂量组、生理盐水组差异极其显著(P<0.01),中剂量组与低剂量组差异极其显著(P<0.01)。(2)免疫组织化学方法检测十二指肠和空肠中阳性细胞和阳性物质仙人掌多糖能明显十二指肠和空肠中阳性表达物的量,且呈现一定的剂量关系。十二指肠和空肠中阳性表达物的量变化基本一致：免疫后第两周,高、中、低三个剂量组(160mg/mL.kg、80mg/mL.kg、40mg/mL.kg)之间差异均极其显著(P<0.01),且高剂量组、中剂量组均与生理盐水组差异显著(P<0.01),低剂量组与生理盐水组无统计学差异。免疫后第三周,高剂量组与中剂量组、生理盐水组差异极其显著(P<0.01)。但在免疫后第四周,高剂量组与生理盐水组中的阳性表达物在十二指肠中差异极其显著(P<0.01),在空肠中差异显著(P<0.05),其余组别无统计学差异。由以上结果可知,仙人掌多糖有提高鸡十二指肠、空肠SIgA分泌的作用,仙人掌多糖在160mg/mL.kg、80mg/mL.kg时,能显著提高鸡十二指肠、空肠的肠黏膜免疫能力,提示仙人掌多糖可作为肠道黏膜免疫增强剂应用于生产中。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-9
论文缩略词表  9-10
目录  10-14
第一章 文献综述及研究的目的意义  14-23
  1 植物多糖的研究概况  14-17
    1.1 植物多糖的提取工艺研究概况  14
    1.2 植物多糖含量测定  14-16
      1.2.1 比色法  14-15
      1.2.2 滴定法  15
      1.2.3 高效液相色谱法  15
      1.2.4 其他方法  15-16
    1.3 植物多糖的黏膜免疫增强作用与抗病毒作用研究进展  16-17
      1.3.1 植物多糖的黏膜免疫增强作用  16
      1.3.2 植物多糖的抗病毒作用研究进展  16-17
  2 抗鸡新城疫病毒药物研究概况  17-18
    2.1 中药或天然药物活性提取物对鸡新城疫病毒的作用  17-18
    2.2 中药复方对鸡新城疫病毒的作用  18
  3 黏膜免疫研究进展  18-21
    3.1 黏膜免疫系统的组织结构  18-19
    3.2 黏膜免疫系统的细胞组成  19
    3.3 免疫免疫应答的机理  19-20
    3.4 分泌型IgA与黏膜免疫反应  20-21
      3.4.1 阻抑黏附、抗感染作用  20
      3.4.2 免疫排除作用  20-21
      3.4.3 促进天然抗菌因子的抗菌作用  21
    3.5 黏膜免疫系统在抗感染免疫中的作用  21
  4 目的和意义  21-23
第二章 仙人掌多糖的提取工艺  23-35
  1 材料与方法  23-26
    1.1 试验材料  23
    1.2 试验仪器  23-24
    1.3 试验方法  24-26
      1.3.1 仙人掌多糖的提取流程  24
      1.3.2 多糖的含量测定标准曲线的建立  24
      1.3.3 蛋白质的含量测定标准曲线的建立  24
      1.3.4 多糖总糖含量测定的方法学验证  24-25
      1.3.5 多糖的定性鉴定  25
      1.3.6 仙人掌多糖提取工艺研究  25-26
  2 结果分析  26-32
    2.1 蛋白质标准曲线的建立  26-27
    2.2 多糖总糖标准曲线的建立  27
    2.3 多糖总糖含量测定方法学验证  27-28
    2.4 多糖的定性鉴定  28
    2.5 单因素考察  28-32
    2.7 仙人掌多糖的最佳工艺条件验证试验  32
    2.8 仙人掌多糖中蛋白含量的测定  32
  3 讨论  32-35
    3.1 多糖总糖含量的测定  33
    3.2 蛋白含量的测定  33-34
    3.3 仙人掌多糖提取工艺考察  34-35
第三章 仙人掌多糖体外抗鸡新城疫病毒作用  35-43
  1 材料与方法  35-37
    1.1 试验材料  35
    1.2 试验仪器  35-36
    1.3 试验方法  36-37
      1.3.1 鸡新城疫病毒滴度的测定  36
      1.3.2 仙人掌多糖对BHK细胞的细胞毒性(MTT法)  36
      1.3.3 仙人掌多糖对鸡新城疫病毒(Mukteswar株Ⅰ系)的体外作用  36-37
  2 试验结果  37-40
    2.1 细胞形态  37-38
    2.2 鸡新城疫病毒滴度的测定  38
    2.3 仙人掌多糖对BHK细胞的细胞毒性  38-39
    2.4 仙人掌多糖对鸡新城疫病毒(Mukteswar株Ⅰ系)的作用  39-40
      2.4.1 先加仙人掌多糖后攻NDV  39
      2.4.2 仙人掌多糖与NDV作用后再加入BHK细胞  39
      2.4.3 NDV感染BHK后再加仙人掌多糖  39-40
  3. 讨论  40-43
第四章 仙人掌多糖对鸡肠道粘膜免疫的影响  43-56
  1 试验材料与方法  43-47
    1.1 试验材料  43
    1.2 主要试剂及其配制  43-44
    1.3 仪器  44
    1.4 动物分组及处理  44
    1.5 抗体滴度的检测  44-45
      1.5.1 微量α法检测鸡新城疫抗原  44-45
      1.5.2 血凝β法抑制试验检测鸡新城疫抗体  45
    1.6 ELISA试剂盒检测肠黏液中SIgA含量  45
    1.7 免疫组织化学  45-47
      1.7.1 组织样品的采集  45
      1.7.2 载玻片和盖玻片的准备  45-46
      1.7.3 石蜡切片制作  46
      1.7.4 SABC染色  46
      1.7.5 结果处理  46-47
  2 试验结果  47-52
    2.1 抗体滴度的测定结果  47-48
    2.2 ELISA试剂盒检测肠黏液中SIgA含量  48-50
      2.2.1 SIgA标准曲线的建立  48-49
      2.2.2 ELISA检测结果  49-50
    2.3 免疫组织化学结果  50-52
      2.3.1 SIgA的分布情况  50
      2.3.2 仙人掌多糖对鸡十二指肠SIgA阳性细胞的影响  50-51
      2.3.3 仙人掌多糖对鸡空肠SIgA的影响  51-52
  3 讨论  52-56
    3.1 抗体效价的动态变化  52-53
    3.2 仙人掌多糖对鸡肠道中SIgA的影响  53-56
      3.2.1 肠道中SIgA检测  53
      3.2.2 免疫组织化学  53-56
第五章 结论  56-57
参考文献  57-63
致谢  63-64
附图及说明  64-66

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家禽 > 鸡
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