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PC-1转基因鼠模型构建及相关基因FilaminA功能研究

作　者: 杨志伟
导　师: 潘大仁；周建光
学　校: 福建农林大学
专　业: 生物化学
关键词: PC-1基因 MPP 转基因鼠 Filamin A基因
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

1999年,周建光研究员筛选并克隆了PC-1基因。前期的研究表明,该基因在雄激素非依赖、可转移的前列腺癌细胞C4-2中高表达,而在雄激素依赖、不转移的前列腺癌细胞LNCaP中低表达;主要在前列腺组织特异性表达;表达受雄激素调控。推测其可能在前列腺癌由雄激素依赖到非依赖过渡中发挥一定的作用,其过表达可能与前列腺癌进展相关。本研究室早期还克隆得到了mPC-1基因上游1.1kb的启动子序列。该启动子具有相对明显的前列腺细胞表达特异性,其转录活性比前列腺特异性抗原PSA启动子和人PC-1基因(hPC-1)5kb启动子活性高很多。为了提高该启动子的转录活性并改善其组织特异性,对其进行了改构,获得了14-ERE和23-ERE(本研究中称为MPP)两个新的启动子。将14-ERE和23-ERE定向克隆到质粒pGL3-Basic上,得到的质粒命名为p14-ERE和p23-ERE。本研究采用双荧光素酶活性检测显示,p14-ERE和p23-ERE在前列腺癌细胞及乳腺癌细胞中表达,但是在前列腺癌细胞中活性更高。进一步的研究发现,与其它对照启动子,如PSA-61,hPC-1 5kb启动子等相比,14-ERE和23-ERE的活性明显高得多。而且,在前列腺癌细胞中23-ERE活性比14-ERE高,在乳腺癌细胞中23-ERE活性比14-ERE低,即23-ERE具有更好的组织特异性。因此,本研究选择23-ERE(MPP)作为前列腺特异性转基因鼠载体的启动子。转基因鼠模型在前列腺癌的发生、发展机制的研究中发挥了重要作用,同时也是研究特定基因体内功能的重要方式。因此,在前期分子和细胞水平对PC-1基因研究的基础上,为进一步研究PC-1基因的体内功能及其在前列腺癌发生、发展过程中可能起的作用,本研究构建了PC-1转基因表达载体。该载体分为广泛性和前列腺特异性两类4种:pCAGGS-PC-1-XhoI、pCAGGS-PC-1-PC-1-NotI和pMPP-PC-1、pMPP-PC-1-NdeI。其中,广泛性表达载体以pCAGGS质粒为基础,pCAGGS-PC-1-XhoI插入1个PC-1基因,pCAGGS-PC-1-PC-1-NotI插入2个串联PC-1基因,为了显微注射时酶切方便,二者都插入了1个Not I位点;pMPP-PC-1、pMPP-PC-1-NdeI两种前列腺特异性载体以pIRES2-EGFP质粒为基础,二者都含有MPP启动子和1个PC-1基因,不同之处为二者的其他构件,具体差别见附录。Western Blot检测显示,转染pCAGGS-PC-1-XhoI和pCAGGS-PC-1-PC-1-NotI质粒的293T细胞中PC-1蛋白表达正常。另外,荧光显微镜观测显示,转染pMPP-PC-1和pMPP-PC-1-NdeI质粒的LNCaP细胞中,绿色荧光蛋白(EGFP)基因皆表达,但转染pMPP-PC-1-NdeI质粒的LNCaP细胞绿色荧光蛋白表达更强且数目更多。鉴于前列腺特异性表达载体更有利于研究,最终选择pMPP-PC-1-NdeI载体用于显微注射。另一方面,为深入研究PC-1基因的功能,我们利用酵母双杂交技术筛选到能够与其相互作用的Filamin A分子(FLNa)。Filamin A是Actin结合蛋白,在不同类型细胞中广泛表达,分子量280KD,以同源二聚体形式存在,结构包含N-端和actin相作用的结构域,以及24个由96个氨基酸串联重复组成的结构域。Filamin A是一个多功能蛋白分子,在细胞骨架的组装、信号传导、蛋白分子的细胞核定位等方面发挥作用。研究发现,Filamin A能够在前列腺癌细胞中和雄激素受体(AR,androgen receptor)相互作用,调控雄激素受体信号通路的活性。在本研究中我们设计了Filamin A基因的RNAi载体,有效抑制了Filamin A分子在前列腺癌C4-2细胞中的表达,并通过MTT实验、平板克隆实验分别研究了Filamin A被干涉后细胞功能的改变,从而为进一步研究Filamin A蛋白和PC-1及AR相互作用在前列腺癌发生发展中的生物学意义奠定了基础。

全文目录

中文摘要  8-10
英文摘要  10-13
前言  13-19
  1 前列腺癌背景介绍  13
  2 前列腺癌相关基因PC-1研究进展  13-15
  3 PC-1启动子简介  15
  4 前列腺癌转基因鼠模型研究进展  15-18
  5 Filamin A简介  18-19
第一部分 mPC-1启动子活性检测  19-24
  1 材料与方法  20-21
    1.1 材料  20
    1.2 方法  20-21
  2 结果与讨论  21-23
    mPC-1启动子活性检测  21-23
  3 小结  23-24
第二部分 PC-1表达载体构建  24-41
  1 材料与方法  25-32
    1.1 材料  25-26
    1.2 方法  26-32
  2 结果与讨论  32-40
    2.1 p MPP-PC-1载体构建  32-37
      2.1.1 PC-1基因的获得  33
      2.1.2 pPC-1-IRES2-EGFP载体构建  33-34
      2.1.3 pPC-1-IRES2-EGFP-PstI载体构建  34-35
      2.1.4 pMPP-Cre载体的改构  35-36
      2.1.5 p MPP-PC-1-0.8载体构建  36
      2.1.6 p MPP-PC-1载体构建  36-37
    2.2 pCAGGS-PC-1-NotI载体构建  37-38
      2.2.1 pCAGGS-NotI载体构建  37-38
      2.2.2 pCAGGS-PC-1-NotI载体构建  38
    2.3 pCAGGS-PC-1-PC-1-NotI载体构建  38-39
      2.3.1 pCAGGS-PC-1载体构建  38
      2.3.2 pCAGGS-PC-1-NotI载体构建  38-39
      2.3.3 pCAGGS-PC-1-PC-1-NotI载体构建  39
    2.4 pMPP-PC-1-NdeI载体构建  39-40
      2.4.1 pPC-1-IRES2-EGFP载体构建  39
      2.4.2 pMPP-PC-1-NdeI载体构建  39-40
  3 小结  40-41
第三部分显微注射制备PC-1转基因鼠  41-47
  1 材料与方法  41-43
    1.1 材料  41
    1.2 方法  41-43
  2 结果与讨论  43-46
    2.1 p MPP-PC-1载体构建效果验证  43-44
    2.2 pCAGGS-PC-1-XhoI和pCAGGS-PC-1-PC-1-NotI载体构建效果验证  44
    2.3 pMPP-PC-1-NdeI载体构建效果验证  44-45
      2.3.1 绿色荧光检测pMPP-PC-1-NdeI载体构建效果  44-45
      2.3.2 Western-blot检测PC-1蛋白表达  45
    2.4 显微注射  45-46
  3 小结  46-47
第四部分 Filamin A基因功能研究  47-56
  1 材料与方法  47-49
    1.1 材料  47
    1.2 方法  47-49
  2 结果与讨论  49-55
    2.1 PC-1影响Filamin A的表达  49-50
    2.2 Filamin A的表达谱  50-51
    2.3 Filamin A表达的干涉  51-53
      2.3.1 发夹siRNA模板的设计和表达载体的构建  51
      2.3.2 RNAi载体构建的PCR鉴定  51-52
      2.3.3 Filamin A siRNA对Filamin A基因表达的影响  52-53
      2.3.4 建立抑制Filamin A表达的前列腺癌细胞株  53
    2.4 干涉Filamin A导致C4-2细胞对辐射抵抗力增强  53-54
    2.5 干涉Filamin A促进C4-2细胞生长  54-55
  3 小结  55-56
结论  56-57
参考文献  57-60
缩略词表  60-61
致谢  61-62
引物及说明  62-63
载体构建流程  63-67

PC-1转基因鼠模型构建及相关基因FilaminA功能研究

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