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前列腺癌相关基因PC-1功能研究及其调控通路初探

作　者: 李素萍
导　师: 陈亮；周建光
学　校: 厦门大学
专　业: 细胞生物学
关键词: PC-1基因受体酪氨酸蛋白激酶信号通路鸟苷酸交换因子
分类号: R737.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

PC-1基因是周建光研究员发现并克隆的新基因,该基因在雄激素非依赖、可转移的前列腺癌晚期细胞系C4-2中高表达,而在雄激素依赖、不转移的前列腺癌早期细胞系LNCaP中低表达。PC-1属于癌蛋白TPD52家族,编码一个包含224个氨基酸的蛋白分子,C端180个氨基酸与D52家族蛋白序列高度同源的,N端46个氨基酸是其特异的区域。TPD52家族成员在多种类型肿瘤中高表达,基因表达与细胞的增殖和恶变相关。不同于TPD52家族成员,PC-1基因表达受雄激素正调控,主要在前列腺组织中表达。前期的研究发现PC-1基因定位于染色体8q21.1区域,该区域在前列腺癌组织标本中普遍扩增。利用前列腺癌的临床组织样本做免疫组化试验表明,PC-1基因在前列腺癌和前列腺内皮增生(PIN)的样本中的表达普遍较正常前列腺样本中低。将PC-1基因在小鼠成纤维NIH3T3细胞中稳定性高表达的结果显示,该基因可使永生化的NIH3T3细胞向恶性肿瘤细胞转化。前期的研究提示PC-1基因可能作为癌基因特异性的在前列腺癌中起作用。为了研究PC-1基因表达在前列腺癌发展中的作用以及发挥作用的分子机制,本研究首先建立稳定高表达PC-1基因的细胞株C4-2B-PC-1及其对照细胞株C4-2B-neo。以这两个细胞株为基础,利用MTT实验、软琼脂集落形成实验,同时用RT-PCR和Real time PCR检测了基因表达谱的变化,探讨PC-1基因在C4-2B细胞中的功能。我们发现PC-1基因高表达之后引起了C4-2B细胞的增殖和恶性程度的提高,在撤除雄激素的条件下促进C4-2B细胞生长,并能导致一系列生长分化基因表达的改变。为了研究PC-1基因发挥功能的分子机制,我们进一步研究了LNCaP-PC-1和对照细胞中受PC-1基因表达所调控的基因,重点研究了受体酪氨酸蛋白激酶(RTK)信号通路成员EphA3和SGEF/CSGEF。通过一系列实验探讨了这两个分子的功能,尝试着去解释PC-1基因发挥功能的方式,其参与的信号的通路,或者受其调控的通路。我们的结果证明EphA3和SGEF/CSGEF能够发生相互作用,而EphA3和SGEF/CSGEF是PC-1基因的应答分子,提示PC-1基因可能通过调控RTK信号通路来影响前列腺癌的发生发展。利用GST pull down实验,免疫共沉淀实验Co-IP实验发现SGEF与雄激素受体AR能够在体内体外相互作用。进一步利用GST pull down实验和哺乳动物双杂交实验确定与AR发生相互作用的区域是SGEF的PH domain,而与SGEF发生相互作用的是AR的配体结合结构域LBD。另外独立的研究证明PC-1能够与AR发生相互作用,由雄激素激活的雄激素受体信号通路在前列腺的分化、维持和前列腺癌的发展中起到重要的作用,而我们的研究提示PC-1基因参与的RTK信号通路与雄激素受体信号通路之间存在着某种联系,同时也说明PC-1基因参与的调控体系是一个复杂的的网络。为研究SGEF/CSGEF在前列腺癌中的功能,我们制备了其兔多克隆抗体。得到了特异性较好,效价较高的兔抗血清。为了研究与AR相互作用的SGEF对雄激素受体的转录激活活性的影响。我们进一步在LNCaP细胞的瞬时转染体系中利用PSA-Luc和ARE-Luc的报告基因进行分析,发现SGEF/CSGEF对AR的转录活性没有明显的影响。本研究从细胞和分子水平研究了PC-1基因在前列腺癌发展中的作用,并对其参与的信号通路做了初步的探讨。为确立PC-1基因作为前列腺癌新的治疗靶标提供了分子生物学基础。

全文目录

中文摘要  8-10
英文摘要  10-12
前言  12-22
  1 前列腺癌背景介绍  12-13
  2 TPD52 家族基因的研究进展与前列腺癌相关基因 PC-1  13-15
  3 雄激素受体AR在前列腺癌进展中的扮演的角色  15-18
  4 RTK 信号通路与鸟嘌呤核苷酸交换因子简介  18-22
第一部分 PC-1 基因功能的研究  22-37
  1 材料与方法  22-30
    1.1 材料  22-24
    1.2 实验方法  24-30
  2 结果与分析  30-34
    2.1 建立稳定转染pcDNA3.1和pcDNA3.1-PC-1的C4-28细胞株  30-31
    2.2 雄激素对稳定转染PC-1 基因C4-28 细胞株生长的影响  31
    2.3 PC-1基因提高C4-28细胞形成集落的能力  31-33
    2.4 PC-1 基因高表达对C4-28 细胞基因表达谱的影响  33-34
  3 小结与讨论  34-37
第二部分 PC-1 基因调控通路初探  37-61
  1 材料与方法  37-45
    1.1 材料  37-38
    1.2 实验方法  38-45
  2 结果与分析  45-59
    2.1 Real-time PCR 对芯片中EphA3、SGEF 表达量变化的验证  45
    2.2 SGEF/CSGEF 基因在前列腺癌细胞系中的功能初探  45-50
      2.2.1 SGEF/CSGEF 的细胞系表达谱  47-48
      2.2.2 SGEF/CSGEF表达与PC-1的关系  48-49
      2.2.3 SGEF/CSGEF 表达与雄激素的关系  49-50
    2.3 鸟苷酸交换因子 S G E F 与 E p h A 3 之间的关系  50-51
    2.4 SGEF与AR的关系  51-56
      2.4.1 GST-pull down实验证明SGEF与AR相互作用  51
      2.4.2 Co IP免疫共沉淀实验证明SGEF与AR在体内相互作用  51-52
      2.4.3 GST-pull down实验确认SGEF与AR相互作用的结构域  52-53
      2.4.4 哺乳动物双杂交实验确认 A R 与 S G E F 相互作用的结构域  53-55
      2.4.5 SGEF/CSGEF对AR转录活性影响的探讨  55-56
    2.5 SGEF 兔多克隆抗体的制备  56-59
      2.5.1 二免后第一次ELISA检测结果  56-57
      2.5.2 二免后第一次ELISA 检测结果  57-59
      2.5.3 SGEF/CSGEF 兔抗血清做western 检测结果  59
  3 小结与讨论  59-61
结论  61-62
参考文献  62-67
缩略词表  67-68
引物  68-71
致谢  71-72

前列腺癌相关基因PC-1功能研究及其调控通路初探

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