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酒酒球菌mleA和mleP基因的克隆及其在酿酒酵母中的转化与表达

作　者: 刘延琳
导　师: 李华；张博润
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 果树学
关键词: 酒酒球菌苹果酸-乳酸酶基因苹果酸通透酶基因克隆与表达共表达酿酒酵母
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵是葡萄酒酿造的两个重要生化过程,通常由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和酒酒球菌(Oenococcus oeni)完成。苹果酸-乳酸酶基因(mleA)和苹果酸通透酶基因(mleP)是O. oeni 进行苹果酸-乳酸发酵(MLF)的两个关键基因。为了避免乳酸菌在发酵过程中产生不必要或不安全次生代谢物质,减少细菌引发葡萄酒微生物破败的危害,经济有效地控制葡萄酒发酵,缩短葡萄酒酿造周期,本项目利用前期研究筛选出的酒酒球菌优良菌系,克隆其mleA 基因和mleP 基因并转化S.cerevisiae,进行它们在S.cerevisiae 中的转化、表达、相互作用及共表达研究,得出的主要结论如下: 1. 酒酒球菌mleA 基因的克隆及其在酿酒酵母中的转化与表达苹果酸-乳酸酶是进行MLF 的功能酶。本研究利用西北农林科技大学葡萄酒学院首次在国内筛选出的酒酒球菌优良菌系Oenococcus oeni SD-2a,进行其苹果酸-乳酸酶基因mleA 的克隆及其在S.cerevisiae 中的转化与表达研究: (1)构建了O.oeni SD-2a苹果酸-乳酸酶基因的重组质粒pLmleA并测序(GenBank登录的序列号为AY786176);测序分析表明克隆到的基因序列与GenBank 已报导序列(序列号X82326)同源性为99%,有两个碱基发生变化,其中一个为错义突变,编码的氨基酸由Asp 变为Glu,并缺少了BamHI 位点; (2)以PGK1 强启动子和ADH1 终止子为调控元件,以大肠杆菌-酵母菌附加体型穿梭质粒YEp352 及整合型质粒YIp5 为载体,构建了包含mleA 基因的重组表达质粒pYELmleA、pYELmleAP 和pYILmleA; (3)用重组表达质粒pYELmleA、pYELmleAP 及pYILmleA转化酿酒酵母YS58,用SD/-Ura 培养基平板筛选鉴定,得到了相应的酵母转化子YS58/pYELmleA、YS58/ pYELmleAP 和YS58/pYILmleA;

全文目录

第一章文献综述  15-49
  1.1 苹果酸-乳酸菌与酒酒球菌  15-16
  1.2 酒球菌研究中的一些热点问题  16-26
    1.2.1 酒球菌属的分类鉴定  16-18
    1.2.2 葡萄酒酿造中苹果酸-乳酸发酵的不利影响  18-20
    1.2.3 苹果酸-乳酸发酵过程中的含氮化合物代谢  20-22
    1.2.4 酒酒球菌抗性相关蛋白及抗性基因  22-23
    1.2.5 酒酒球菌的溶源性和其诱导的噬菌体  23-24
    1.2.6 酒酒球菌的物理图谱及质粒  24-26
  1.3 基因工程途径降解苹果酸的研究进展  26-33
    1.3.1 果酒生物降解苹果酸的途径  26
    1.3.2 苹果酸-乳酸发酵相关酶  26-28
    1.3.3 苹果酸-乳酸发酵相关基因的克隆与外源表达研究  28-30
    1.3.4 苹果酸-酒精发酵的相关酶、基因及外源表达  30-31
    1.3.5 苹果酸-乳酸酶基因和苹果酸通透酶基因共表达的研究  31-33
    1.3.6 存在问题  33
  1.4 酿酒酵母表达体系  33-37
    1.4.1 酿酒酵母载体的基本结构  34
    1.4.2 酵母菌的载体系统  34-35
    1.4.3 几个酵母载体简介  35-37
  1.5 葡萄酒酵母工程菌  37-40
    1.5.1 增香作用  37
    1.5.2 促进果胶分解  37-38
    1.5.3 增强葡萄酒抗氧化作用  38
    1.5.4 增酸作用  38-39
    1.5.5 基因重组酵母的问题与展望  39-40
  参考文献  40-49
引言本研究的目的意义及研究内容  49-51
第二章酒酒球菌mleA 基因的克隆及在酿酒酵母中的转化与表达  51-85
  2.1 材料与方法  52-67
    2.1.1 菌株与质粒  52-53
    2.1.2 工具酶、抗生素及试剂  53
    2.1.3 仪器  53
    2.1.4 培养基及培养条件  53-55
    2.1.5 缓冲液与试剂及配制  55-59
    2.1.6 实验方法  59-67
  2.2 结果与分析  67-81
    2.2.1 Oenococcus oeni SD-2a 基因组 DNA 的提取  67
    2.2.2 O. oeni SD-2a mleA 基因的PCR 扩增  67-68
    2.2.3 mleA 基因的重组质粒构建  68-70
    2.2.4 目的基因测序  70-72
    2.2.5 重组表达质粒pYELmleA 的构建  72-73
    2.2.6 重组表达质粒pYELmleAP 的构建  73-75
    2.2.7 整合型重组表达质粒pYILmleA的构建  75-77
    2.2.8 酵母转化及转化子鉴定  77-79
    2.2.9 mleA 基因在酿酒酵母中表达的蛋白检测  79
    2.2.10 酵母转化子的斑点杂交检测  79
    2.2.11 mleA 基因在酿酒酵母中表达的功能检测  79-81
  2.3 小结  81-83
  参考文献  83-85
第三章酒酒球菌mleP 基因的克隆及转化酿酒酵母的研究  85-97
  3.1 材料与方法  85-88
    3.1.1 菌株与质粒  85-86
    3.1.2 工具酶、抗生素及试剂  86
    3.1.3 培养基及培养条件  86
    3.1.4 酒酒球菌基因组DNA 的提取  86
    3.1.5 目的基因的PCR 扩增  86-87
    3.1.6 酶切、连接与测序  87
    3.1.7 大肠杆菌转化与质粒提取  87
    3.1.8 酵母转化及转化子筛选  87
    3.1.9 酵母转化子鉴定  87
    3.1.10 酵母转化子培养液上清中 L-苹果酸浓度测定  87-88
  3.2 结果与分析  88-94
    3.2.1 酒酒球菌SD-2a mleP 基因的PCR 扩增  88
    3.2.2 mleP 基因的重组质粒构建  88-89
    3.2.3 目的基因的序列测定  89-91
    3.2.4 重组表达质粒pYEmleP 的构建及酶切验证  91-93
    3.2.5 pYEmleP 转化酿酒酵母及酵母转化子的鉴定  93-94
    3.2.6 mleP 基因的表达对转运培养液中 L-苹果酸能力的影响  94
  3.3 小结  94-95
  参考文献  95-97
第四章苹果酸-乳酸酶和苹果酸通透酶基因在酿酒酵母中的共表达  97-112
  4.1 材料与方法  97-100
    4.1.1 菌株与质粒  97-98
    4.1.2 工具酶、抗生素及试剂  98
    4.1.3 培养基及培养条件  98
    4.1.4 目的基因的PCR 及重组表达质粒的PCR 鉴定  98-99
    4.1.5 基因操作  99
    4.1.6 酵母转化及转化子筛选  99
    4.1.7 酵母转化子鉴定  99
    4.1.8 转化子的营养缺陷型检测  99
    4.1.9 报告基因表达的检测  99
    4.1.10 mleA 基因及mleP 基因的表达及共表达功能检测  99-100
  4.2 结果与分析  100-110
    4.2.1 重组表达质粒pGBLmleA 的构建及酶切验证  100-101
    4.2.2 重组表达质粒pGALmleP 的构建及酶切验证  101-103
    4.2.3 酵母转化及转化子鉴定  103
    4.2.4 共转化与转化子鉴定  103-104
    4.2.5 自激活检测  104
    4.2.6 酵母双杂交检测  104-105
    4.2.7 mleA 与mleP 基因表达功能检测  105-110
  4.3 小结  110-111
  参考文献  111-112
第五章讨论与结论  112-121
  5.1 讨论  112-117
    5.1.1 酿酒酵母(S.cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Sz. pombe)的苹果酸代谢  112-113
    5.1.2 目的基因在酿酒酵母中的表达及表达的效率  113-115
    5.1.3 不同来源mle 和mleP 的同源性分析  115-117
  5.2 结论  117-119
  参考文献  119-121
致谢  121-122
个人简介  122-123
附录1 mleA 基因测序图谱  123-126
附录2 mleP 基因测序图谱  126-128
附录3 HPLC 色谱图  128-130

酒酒球菌mleA和mleP基因的克隆及其在酿酒酵母中的转化与表达

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