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柽柳冷适应蛋白（CAP）基因的功能验证

作　者: 林士杰
导　师: 姜静；王玉成
学　校: 东北林业大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 怪柳 冷适应蛋白基因 酿酒酵母 逆境胁迫 山新杨 功能验证
分类号: S793.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 214次
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内容摘要


本研究将从极度抗旱、耐盐、抗寒木本植物柽柳（Tamarix androssowii）中克隆得到的冷适应蛋白（cold acclimation protein，cap）基因，构建到酵母表达载体pYES2和植物表达载体pROKⅡ中，进一步在真核细胞中验证cap基因的功能。主要实验结果如下：（1）将cap基因与酵母表达载体pYES2连接，获得了pYES2-cap重组质粒。将pYES2-cap转化酵母菌INVSc1。随机挑选10个INVSc1（pYES2-cap）单菌落，经PCR检测证明cap基因已构建到pYES2载体上。对1NVSc1（pYES2-cap）和INVSc1（pYES2）菌株进行诱导，研究外源基因在酵母中的的表达情况。Northern杂交结果表明，cap基因已经在重组酵母INVSc1（pYES2-cap）中表达。（2）重组酵母INVSc1（pYES2-cap）的NaCl、Na2CO3、NaHCO3、干旱、紫外线等胁迫，实验表明，INVSc1（pYES2-cap）酵母的抗逆性明显高于对照INVSc1（pYES2）菌株，说明在酵母受到逆境胁迫时，cap基因表达的冷适应蛋白对酵母细胞起到了保护作用，同时也证实了柽柳的cap基因具有提高真核生物抗逆性的功能。（3）对山新杨进行遗传转化，获得卡那霉素抗性芽，从中随机选出8个株系，进行PCR和Southern斑点杂交，证明cap基因已整合到山新杨基因组中；进一步对8个株系进行RT-PCR和Northern杂交检测，结果表明外源基因能够在转录水平上表达。（4）分别对7个转基因山新杨移栽苗进行了低温胁迫试验，测定并分析了胁迫后叶绿素含量、相对电导率、丙二醛（MDA）含量，结果显示，随着低温胁迫时间的加剧，非转基因山新杨叶绿素含量明显下降，胁迫1d后转基因山新杨叶绿素含量平均高于对照20.49％；在冷胁迫下，转基因山新杨相对电导率平均值低于对照山新杨的33.88％；对照山新杨MDA含量为34.18μmoL.g-1，而转基因山新杨MDA含量大多在18.86～33.14μmoL.g-1左右，低于对照山新杨，上述指标均说明cap基因的导入提高了山新杨的抗低温能力。（5）分别对8个转基因株系进行了NaCl胁迫，分析逆境胁迫条件下转基因山新杨与非转基因对照山新杨的丙二醛（MDA）含量、相对电导率等指标的变化。结果表明，NaCl胁迫处理后，各株系的相对电导率、MDA含量都逐渐增大，各转基因株系相对电导率平均值低于对照山新杨的15.34％，MDA平均含量低于对照的23.21％，综上说明，盐胁迫条件下，转基因山新杨受害程度明显小于对照。重组酵母的胁迫实验及转基因山新杨的低温、耐盐实验说明，cap基因的表达能够提高真核酵母细胞的抗逆性；cap基因的组成型表达能够不同程度提高转基因山新杨逆境胁迫下的耐受能力，证实cap基因具有提高植物抗低温、耐盐的功能。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-9
1 绪论  9-16
  1.1 怪柳研究概况  9-10
  1.2 低温胁迫对植物的影响  10-12
  1.3 低温诱导蛋白的作用  12-14
  1.4 冷适应蛋白基因  14
  1.5 本项研究的目的和意义  14-16
2 重组酵母pYES2-cap抗逆性分析  16-32
  2.1 材料和方法  16-18
    2.1.1 菌株和质粒  16
    2.1.2 酶和酵母转化主要试剂  16-17
    2.1.3 分子杂交检测主要试剂  17
    2.1.4 重组酵母胁迫处理主要试剂  17
    2.1.5 主要仪器设备  17-18
  2.2 实验方法  18-22
    2.2.1 pYES2质粒的双酶切及纯化  18
    2.2.2 目的基因的双酶切与纯化  18
    2.2.3 重组质粒的构建及转化  18-19
    2.2.4 重组质粒 Top10F｀-pYES2-cap的PCR鉴定  19
    2.2.5 重组质粒 Top10F｀-pYES2-cap的双酶切鉴定  19
    2.2.6 重组质粒的酵母转化及鉴定  19-20
    2.2.7 重组质粒酵母诱导表达  20-21
    2.2.8 重组酵母 INVSc1(pYES2-cap)的胁迫处理  21-22
  2.3 结果与分析  22-30
    2.3.1 pYES2的双酶切  22-23
    2.3.2 cap基因的PCR扩增及酶切  23-24
    2.3.3 重组质粒pYES2-cap的获得  24-25
    2.3.4 重组质粒pYES2-cap酵母的遗传转化  25-26
    2.3.5 酵母菌落 PCR鉴定  26
    2.3.6 重组质粒酵母诱导表达  26-27
    2.3.7 INVSc1(pYES2-cap)酵母抗逆性提高  27-30
  2.4 本章小结  30-32
3 cap基因山新杨的遗传转化及分子检测  32-43
  3.1 实验材料  32-33
    3.1.1 植物材料  32
    3.1.2 菌株和质粒  32
    3.1.3 酶和试剂  32-33
    3.1.4 培养基  33
  3.2 实验方法  33-36
    3.2.1 cap基因植物表达载体的构建  33
    3.2.2 菌种的活化  33-34
    3.2.3 三亲交配法将中间表达载体(含cap基因)转入农杆菌  34
    3.2.4 农杆菌介导的杨树遗传转化  34-35
    3.2.5 转基因山新杨的PCR检测  35
    3.2.6 转基因山新杨 Southern斑点杂交  35-36
    3.2.7 转基因山新杨 RT-PCR和Northern检测  36
    3.2.8 转基因山新杨 Northern印迹杂交  36
  3.3 结果与分析  36-42
    3.3.1 目的基因的扩增及扩增产物的双酶切  36-37
    3.3.2 pROKII的双酶切  37
    3.3.3 目的基因与载体的连接及大肠杆菌的转化  37
    3.3.4 中间表达载体pCAR的鉴定  37-38
    3.3.5 三亲交配转化质粒的PCR电泳检测  38-39
    3.3.6 山新杨高效遗传转化体系的建立  39
    3.3.7 转cap基因山新杨的PCR检测  39-40
    3.3.8 转cap基因山新杨的 Southern斑点杂交  40-41
    3.3.9 转基因山新杨总RNA的提取和纯化  41
    3.3.10 转cap基因山新杨的RT-PCR检测  41
    3.3.11 转cap基因山新杨的Northern杂交  41-42
  3.4 本章小结  42-43
4 转cap基因山新杨的抗低温耐盐性分析  43-52
  4.1 实验材料  43
    4.1.1 植物材料  43
    4.1.2 试剂  43
  4.2 实验方法  43-44
    4.2.1 叶绿素含量的测定  43
    4.2.2 丙二醛(MDA)含量测定  43-44
    4.2.3 相对电导率测定  44
  4.3 结果与分析  44-50
    4.3.1 转cap基因山新杨的抗寒性增强  44-48
    4.3.2 转cap基因山新杨的耐盐性提高  48-50
  4.4 本章小结  50-52
5 讨论  52-58
  5.1 酵母表达系统的选择及目的基因的表达  52-53
    5.1.1 酵母表达系统  52-53
    5.1.2 对目的基因的要求  53
    5.1.3 酵母转化子菌落 PCR检测方法优化  53
  5.2 转cap基因山新杨检测及抗逆性分析  53-56
    5.2.1 转基因植株的检测  53-54
    5.2.2 转基因植株耐盐抗寒性与Northern相关性分析  54-55
    5.2.3 植物体抗性机制的交叉性  55-56
  5.3 cap基因功能评价  56
  5.4 问题和展望  56-58
结论  58-59
参考文献  59-71
攻读学位期间发表的学术论文  71-72
致谢  72-73

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林树种 > 阔叶灌木 > 柽柳
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