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酿酒酵母细胞PKA高活性与细胞热击抗性的研究

作　者: 赵刘
导　师: 马平生
学　校: 天津大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 酿酒酵母 PKA 热击抗性
分类号: Q932
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


酿酒酵母细胞内存在两种与cAMP相关的信号通路,分别由异三聚体G蛋白和小G蛋白Ras介导。酿酒酵母的Ras-cAMP信号通路对酵母细胞的代谢、增殖、分化及胁迫抗性具有重要作用。Ras-cAMP信号通路的下游直接靶标是cAMP依赖性的蛋白激酶A即PKA;当Ras蛋白活性过高时,PKA活性亦随之升高。PKA作为丝/苏氨酸激酶,可令其靶蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化。借助于磷酸化作用,PKA可调节细胞对外界营养条件和压力状况的应激反应过程。研究表明,酿酒酵母细胞PKA的活性可影响细胞的热击抗性;在PKA活性过高的情况下,酿酒酵母细胞的热击抗性较野生型明显降低。为进一步深入探讨PKA高活性与细胞热击抗性之间的关系,本研究从W303-1a YCp22RASval19菌株出发,利用mTn-lacZ/LEU2诱变文库随机插入其染色体的任意部位形成转座子。mTn文库转入W303-1a YCp22RAS2val19菌株后,若转座子插入位点是抗性相关基因的ORF或顺式作用元件,则所形成突变株的热击抗性可能会有所改变。纯化所得转化子,检验其热击抗性,鉴别出六株热击抗性增强突变株;其中ZL7、ZL9和ZL13热击耐受时间高达6min,而ZL10、ZL11和ZL16的热击耐受时间亦增至3min。再用过pRSQ2-URA3质粒回收鉴别转座子在染色体上的插入位点,确认发生突变的基因;其中ZL7突变株为NOP7和RAS2双失活菌株,ZL9突变株为ULP2失活菌株,ZL10和ZL16突变株均为NFS1失活菌株,ZL11突变株为TPK1失活菌株,ZL13突变株为TIM9失活菌株。最后通过构建YCp33ULP2、YCp33TIM9,并将之与现有的YCp33TPK1以及YCp33NOP7质粒分别转化至相应缺失菌株,形成回复突变株,后者恢复野生型菌株的热击抗性,说明ZL7、ZL9、ZL11以及ZL13等四菌株的突变位点确认无误。

全文目录


中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-7
第一章 文献综述  7-20
  1.1 细胞信号转导  7-8
  1.2 Ras  8-9
  1.3 酿酒酵母细胞Ras-cAMP 信号通路  9-15
    1.3.1 Ras 蛋白  9-10
    1.3.2 Cdc25 与Sdc25  10-11
    1.3.3 Ira1与Ira2  11-12
    1.3.4 Cdc35/Cy11  12-13
    1.3.5 Cap/Srv2  13-14
    1.3.6 Pde1 和Pde2  14-15
  1.4 Ras-cAMP 信号通路主要靶标—cAMP 依赖性蛋白激酶PKA  15-17
  1.5 酿酒酵母Ras－cAMP 信号通路的负反馈抑制作用  17-18
  1.6 Ras-cAMP 信号通路、PKA 活性与细胞的胁迫抗性  18
  1.7 本研究的目的和内容  18-20
第二章 材料与方法  20-36
  2.1 实验材料  20-25
    2.1.1 质粒、菌株与引物  20-21
    2.1.2 主要实验仪器  21-22
    2.1.3 主要试剂  22-23
    2.1.4 培养基  23-24
    2.1.5 主要溶液  24-25
  2.2 实验方法  25-36
    2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化  25-27
    2.2.2 大肠杆菌质粒提取方法（CTAB 法）  27
    2.2.3 酵母细胞染色体快速分离  27-28
    2.2.4 PCR 扩增反应  28
    2.2.5 DNA 限制酶切  28-29
    2.2.6 DNA 连接反应  29
    2.2.7 DNA 琼脂糖凝胶电泳  29-30
    2.2.8 琼脂糖凝胶回收DNA  30
    2.2.9 酵母细胞的转化  30-32
    2.2.10 酵母细胞质粒回收  32
    2.2.11 质粒缺口修复（Gap-repair）  32-33
    2.2.12 梯度稀释实验方法  33
    2.2.13 酵母热击实验方法  33-34
    2.2.14 mTn 诱变文库的转化  34-35
    2.2.15 整合质粒的回收  35-36
第三章 结果与讨论  36-55
  3.1 概述  36
  3.2 mTn 突变文库的转化与突变株的筛选  36-40
  3.3 热击抗性增强菌株突变定位  40-46
  3.4 回复突变株表型验证  46-55
    3.4.1 质粒YCp33TIM9 与YCp33ULP2 的构建  46-52
    3.4.2 热击实验  52-55
第四章 总结与展望  55-57
  4.1 工作总结  55
  4.2 工作展望  55-57
参考文献  57-68
致谢  68

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物细胞学
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