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脂肪酸碳链延长酶与脱饱和酶在酿酒酵母中共表达

作　者: 陈晓峰
导　师: 黄建忠
学　校: 福建师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 二十二碳六烯酸 酿酒酵母 共表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 38次
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内容摘要


DHA在人体中有许多重要的生理作用,对维持人体健康是不可或缺的,研究还发现其对改善高血压、关节炎、抑郁症等也有显著效果。DHA由于具有这些特殊生理作用,现今已成为高附加值、市场需求广泛的产品。现今对DHA研究主要集中于利用转基因手段在各种作物和微生物中大量、廉价生产DHA。为利用转基因技术在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中生产二十二碳六烯酸(DHA,22：6△4,7,10,13,16,19 n-3),本文通过基因重组的方法构建了同时含破囊壶菌Thraustochytrium sp. FJN-10△5脂肪酸延长酶(TFD5)基因、△4脂肪酸脱饱和酶(FAD4)基因的共表达质粒PYTFD5-FAD4.该质粒是通过基因重组的方法,使FTD5、FAD4基因置于各自启动子和终止子下获得的。该质粒转化酿酒酵母所构建的重组工程菌,在添加终浓度为2%的半乳糖、终浓度为1%的NP-40和0.3mmol/L的底物二十碳五烯酸(EPA,20：5△5,8,11,14,17 n-3)下进行诱导,可直接转化二十碳五烯酸(EPA,20：5△5,8,11,14,17 n-3)生成二十二碳五烯酸(DPA,22：5△4,7,10,13,16 n-3)和DHA,从EPA到DHA的转化效率为12.47%。为进一步提高转化率,通过基因重组的方法构建了同时含TFD5基因、FAD4基因和酿酒酵母细胞色素b5基因的共表达质粒pYTFD5-FAD4-B5,各基因拥有各自的启动子和终止子。该质粒转化酿酒酵母所构建的工程菌在上述诱导条件下,从DPA到DHA的转化效率未见明显提高,表明启动子是影响本实验转化率的主要因素。

全文目录


中文摘要  2-3
Abstract  3-4
中文文摘  4-6
目录  6-10
第一章 绪论  10-24
  第一节 高度不饱和脂肪酸  10-11
  第二节 DHA主要生理功能  11-12
  第三节 DHA生物合成途径  12-19
    3.1 由多种脂肪酸延长酶和脱饱和酶参与催化的DHA生物合成途径  12-16
      3.1.1 脂肪酸碳链延长酶  13-14
      3.1.2 脂肪酸脱饱和酶  14-15
      3.1.3 细胞色素b5  15-16
    3.2 Polyketide synthase(PKS)DHA生物合成途径  16-17
    3.3 破囊壶菌Thraustochytrium sp.FJN-10中的DHA生物合成途径  17-19
  第四节 DHA的生产现状  19-20
    4.1 DHA传统来源  19-20
    4.2 液体深层发酵生产DHA  20
    4.3 转基因生产DHA  20
  第五节 本课题研究的目的和意义  20-23
  第六节 本课题研究的技术路线  23-24
第二章 共表达质粒pYFTD5-FAD4的构建  24-34
  第一节 前言  24
  第二节 材料和方法  24-30
    2.1 菌种和质粒  24
    2.2 主要培养基和试剂  24
    2.3 主要仪器  24
    2.4 特异引物的设计  24-25
    2.5 FTD5-CYTT片段和PGAL片段的克隆  25
    2.6 FTD5-CYTT-PGAL片段的构建  25-27
    2.7 共表达质粒pYFTD5-FAD4的构建  27-29
    2.8 共表达质粒pYFTD5-FAD4的转化和菌落PCR验证  29
    2.9 共表达质粒pYFTD5-FAD4的提取和酶切鉴定  29-30
  第三节 结果与分析  30-33
    3.1 FTD5-CYTT片段和PGAL片段的克隆  30-31
    3.2 FTD5-CYTT-PGAL片段的构建  31-32
    3.3 菌落PCR验证  32
    3.4 共表达质粒pYFTD5-FAD4的酶切验证  32-33
  第四节 小结与讨论  33-34
第三章 共表达质粒pYFTD5-FAD4在酿酒酵母中的表达  34-42
  第一节 前言  34
  第二节 材料和方法  34-36
    2.1 菌株和质粒  34
    2.2 主要培养基和试剂  34
    2.3 脂肪酸标准品  34
    2.4 主要仪器  34
    2.5 酿酒酵母感受态细胞制备及转化  34-35
    2.6 重组工程菌株的诱导表达  35
    2.7 总脂肪酸提取  35
    2.8 GC-MS分析  35-36
    2.9 重组工程菌稳定性鉴定  36
  第三节 结果和分析  36-39
    3.1 重组工程菌的菌落PCR鉴定  36
    3.2 工程菌的表达结果  36-38
    3.3 脂肪酸转化效率  38-39
    3.4 重组工程菌的稳定性  39
  第四节 小结和讨论  39-42
第四章 共表达质粒PYFTD5-FAD4-B5构建  42-56
  第一节 前言  42
  第二节 材料和方法  42-48
    2.1 菌株和质粒  42
    2.2 主要培养基和试剂  42
    2.3 主要仪器  42
    2.4 酵母DNA的提取  42
    2.5 特异引物的设计  42-43
    2.6 细胞色素b5的克隆  43
    2.7 连接和转化  43
    2.8 菌落PCR验证  43-44
    2.9 序列测定和分析  44
    2.10 质粒pYB5的构建  44
    2.11 菌落PCR鉴定和质粒提取  44
    2.12 共表达质粒pYFTD5-FAD4-B5构建  44-47
    2.13 共表达质粒pYFTD5-FAD4-B5的转化和菌落PCR鉴定  47
    2.14 共表达质粒pYFTD5-FAD4-B5酶切鉴定  47-48
  第三节 结果与分析  48-53
    3.1 酿酒酵母DNA的提取和检测  48
    3.2 酵母细胞色素b5的克隆  48-49
    3.3 阳性克隆子的筛选  49
    3.4 序列测定和同源性分析  49-51
    3.5 pYB5质粒的构建和鉴定  51-52
    3.6 共表达质粒的构建和酶切鉴定  52-53
  第四节 小结与讨论  53-56
第五章 共表达质粒pYFTD5-FAD4-B5在酿酒酵母中的表达  56-64
  第一节 前言  56
  第二节 材料和方法  56-57
    2.1 菌株和质粒  56
    2.2 主要培养基和试剂  56
    2.3 脂肪酸标准品  56
    2.4 主要仪器  56
    2.5 酿酒酵母感受态细胞制备及转化  56
    2.6 酿酒酵母诱导表达  56
    2.7 总脂肪酸提取  56
    2.8 GC-MS分析  56-57
    2.9 重组工程菌稳定性分析  57
  第三节 结果与分析  57-62
    3.1 重组酿酒酵母工程菌的构建  57-58
    3.2 工程菌的诱导表达结果  58-60
    3.3 脂肪酸转化效率  60-61
    3.4 重组工程菌稳定性结果  61-62
  第四节 小结与讨论  62-64
第六章 结论  64-66
附录 主要符号对照表  66-68
参考文献  68-73
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  73-74
致谢  74-76
个人简历  76-78

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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