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siRNA干扰VEGF-C表达抑制胃癌淋巴生成的实验研究

作　者: 陈正荣
导　师: 邢春根
学　校: 苏州大学
专　业: 普外科
关键词: 淋巴内皮细胞生长因子-C(VEGF-C) RNA干扰 胃癌 淋巴生成
分类号: R735.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


目的:在体外,应用RNA干扰(RNAi)的方法抑制胃腺癌细胞株SGC7901淋巴内皮生长因子-C(VEGF-C)的表达,探讨其抑制SGC7901细胞VEGF-C表达的有效性,并筛选有效的小干扰RNA(siRNA);建立BALB/c裸鼠SGC7901皮下移植瘤模型,在体内,研究瘤内注射siRNA抑制VEGF-C表达能否导致胃癌生长受抑和胃癌淋巴管生成受抑。方法:体外实验:设计并化学合成siRNA,并通过非变性凝胶电泳(PAGE)纯化;脂质体介导siRNA转染胃腺癌细胞株SGC7901,观察细胞形态变化,并四氮唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖;荧光素6-Fam标记的siRNA转染SGC7901细胞,荧光显微镜观察并计算siRNA转染SGC7901细胞的效率;半定量RT-PCR检测不同siRNA实验分组细胞VEGF-C mRNA水平变化;半定量RT-PCR和Western blot法检测经VEGF-C小干扰RNA(VEGF-CsiRNA)干预后SGC7901细胞随时间变化mRNA和蛋白水平的变化。体内实验:裸鼠皮下注射SGC7901细胞构建胃癌皮下移植瘤模型24只,随机分为4组为:siRNA脂质体混合液注射组、单脂质体注射组、单siRNA注射组和PBS注射组,当肿瘤直径达0.5cm,即进行VEGF-CsiRNA瘤内注射,每隔6天注射一次,共注射3次,随后记录各实验组肿瘤体积变化,免疫组织化学法检测各实验组肿瘤组织VEGF-C的表达,并通过抗人CD31和LYVE-1单克隆抗体检测瘤体内血管和淋巴管生成情况。结果:体外实验:脂质体介导siRNA体外转染SGC7901细胞,VEGF-CsiRNA转染组出现细胞生长减慢,但MTT结果显示未转染组、单用脂质体组和转染VEGF-CsiRNA干扰组细胞凋亡情况无明显差异(P>0.05);6-Fam标记的siRNA和GAPDHsiRNA分别转染SGC7901,显示siRNA在工作浓度为100mmol/L转染效率最优化,其转染效率为37.03%±3.0%,内源性基因GAPDHmRNA下调为未转染组的65.5%±3.3%;半定量RT-PCR筛选结果显示No.1VEGF-CsiRNA为有效的敲减VEGF-C表达的小干扰RNA,使VEGF-CmRNA下调为对照组的52.5%±2.6%,且在转染后48h左右出现VEGFmRNA的敲减高峰,VEGF-CmRNA水平下调为对照组的43.5%;Western blot检测显示VEGF-C蛋白的表达下调为对照组的32.7%±1.1%,且在转染72h后出现VEGF-C蛋白的敲减高峰,蛋白水平下调为对照组的18.9%。体内实验:VEGF-CsiRNA干扰组较对照组肿瘤生长明显减慢(P<0.001),siRNA加用脂质体干扰组和单用siRNA干扰组肿瘤生长无明显差别(P>0.05)。免疫组化抗人VEGF-C单抗检测干扰组肿瘤细胞VEGF-C染色减弱,和对照组相比VEGF-C表达下调68.3%(P<0.01),同时抗人LYVE-1单抗免疫组化染色表明胃癌组织中淋巴生成减少,干扰组LVD值为3.2±1.3,而对照组为9.8±2.7,VEGF-CsiRNA干扰组LVD值下降至对照组的32.7%(P<0.01),而干扰组和对照组的MVD值无明显差异(P>0.05)。结论:本实验筛选的siRNA能有效抑制胃癌细胞的VEGF-C基因mRNA和蛋白水平的表达,在体外干扰VEGF-C的表达,能使细胞出现生长减慢但不能使细胞发生凋亡。在胃癌动物模型中,瘤内注射VEGF-CsiRNA能显著下调肿瘤组织内VEGF-C的表达,抑制胃癌皮下瘤生长,同时抑制瘤内淋巴管生成,而对肿瘤血管生成无影响。提示下调VEGF-C表达能抑制胃癌淋巴生成。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-9
引言  9-12
第一部分 小干扰RNA 抑制胃腺癌细胞株VEGF-C 表达的实验研究  12-40
  材料和方法  12-27
    （一） 材料  12-16
    （二） 方法  16-27
  结果  27-35
  讨论  35-38
  参考文献  38-40
第二部分 小干扰RNA 抑制胃癌裸鼠移植瘤模型淋巴生成的实验研究  40-53
  材料与方法  40-43
    （一） 材料  40-41
    （二） 方法  41-43
  结果  43-49
  讨论  49-51
  参考文献  51-53
结论  53-54
综述 胃癌淋巴生成与胃癌的转移  54-65
  一、淋巴系统的结构和功能  54-55
  二、淋巴生成与淋巴生长因子  55-56
  三、肿瘤中淋巴生成与淋巴转移  56
  四、胃癌中的淋巴生长因子与淋巴生成和转移  56-58
  五、胃癌的淋巴生成抑制  58-59
  参考文献  59-65
攻读硕士学位期间公开发表论文  65-66
中英文缩略词表  66-67
致谢  67-68

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胃肿瘤
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