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日本血吸虫Argonaute蛋白的初步研究

作　者: 杨燕萍
导　师: 刘宗平；程国锋
学　校: 扬州大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 日本血吸虫 Argonaute蛋白 RACE 功能分析
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


血吸虫病是由血吸虫感染引起的分布广泛、危害严重的人兽共患寄生虫病。血吸虫不同发育阶段虫体呈现独特的代谢和发育特征及显著的生物学和形态学变化,必然存在不同的基因差异表达模式,非编码小RNA在生物体的生长发育中发挥重要的调节作用,最近研究表明Argonuate家族蛋白参与此进程。本研究利用RACE技术获得2个编码日本血吸虫Argonaute蛋白的全长cDNA;利用荧光实时定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段的转录情况;构建原核表达质粒pET-28b-SjAGO1-PIWI和pET-32a-SjAGO1以及pET-28b-SjAGO2-PIWI,利用原核表达获取重组保守功能域蛋白和全长重组蛋白并制备相关抗体;利用免疫印迹方法和RNAi初步分析了日本血吸虫Argonaute蛋白的功能。结果表明:(1)RACE技术克隆获得了编码日本血吸虫Argonaute1蛋白(SjAGO1)的全长cDNA,包含3030 bp的完整开放阅读框,编码1009个氨基酸,预测分子量为111.7 kDa;生物信息学分析表明该基因编码的蛋白序列具有Argonaute家族蛋白的典型结构域特征,且与人和鼠等Argonaute蛋白具有较高的同源性;荧光实时定量PCR表明该基因在7,14日龄的日本血吸虫童虫中转录较高;利用重组表达的保守功能域蛋白制备了特异性较高的多克隆抗体;免疫印迹分析表明SjAGO1在雄虫中高表达。(2)RACE技术克隆获得日本血吸虫Argonaute2蛋白(SjAGO2)的全长cDNA基因,包含2808 bp的开放阅读框,编码935个氨基酸,预测分子量为106.0 kDa;生物信息学分析表明该蛋白与曼氏血吸虫AGO2相似性为83%;利用重组表达的保守功能域蛋白制备了特异性较高的多克隆抗体。免疫印迹分析该蛋白在成虫中尤其在雄虫中高表达。(3)RNA干扰SjAGO1基因后,干扰组虫体存活率仅为空白组的52.4%、39.2%、58.4%,虫体活力较低。荧光定量PCR表明干扰组日本血吸虫SjAGO1的转录量仅为空白组的2.0%、4.5%、3.2%,干扰组SjAGO1蛋白表达量明显低于空白组。结论:本论文首次获得2个编码日本血吸虫Argonaute蛋白的基因,成功将SjAGO1和SjAGO2的保守结构域在大肠杆菌中进行了表达,利用纯化蛋白免疫昆明鼠制备了相应抗体;成功筛选出对SjAGO1基因具有干扰作用的siRNA。本研究结果,为深入研究日本血吸虫Argonaute蛋白功能奠定了基础,为深入揭示血吸虫生长,特别是童虫发育及性别发育成熟机制提供了新途径,也对研制早期干预血吸虫生长和抗血吸虫生殖产卵的高效疫苗和药物有重要意义。

全文目录


中文摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
符号说明  8-12
上篇 文献综述  12-22
  第一章 血吸虫生物学概论  12-15
    1 血吸虫病  12
    2 血吸虫生活史  12-13
    3 血吸虫致病作用  13-14
    4 血吸虫病的防治  14-15
  第二章 RNA 干扰技术的研究概况  15-20
    1 RNA 干扰现象的发现  15-16
    2 RNA 干扰的原理  16-17
    3 RNA 干扰技术的应用  17-20
      3.1 RNAi 在基因组学中的应用  18
      3.2 RNAi 在抗病毒治疗中的应用  18-19
      3.3 药物开发  19-20
  第三章 Argonaute 蛋白研究进展  20-22
    1 Argonaute 蛋白家族  20
    2 Argonaute 蛋白结构  20-22
下篇 研究内容  22-82
  第一章 日本血吸虫 AGO1 蛋白的研究  22-54
    1 材料  22-23
      1.1 实验动物  22
      1.2 主要试剂  22-23
      1.3 主要仪器  23
    2 方法  23-39
      2.1 溶液的配制  23-26
      2.2 EST 来源和RACE 引物  26
      2.3 总RNA 的提取  26-27
      2.4 5' RACE 扩增  27-31
      2.5 AGO1 生物信息学分析  31
      2.6 实时荧光定量PCR 检测AGO1 期别转录差异  31-33
      2.7 AGO1 保守功能域及全长的原核表达质粒的构建  33-36
      2.8 AGO1 保守功能域及全长蛋白的原核表达  36-37
      2.9 重组蛋白的纯化  37-38
      2.10 AGO1 多克隆抗体的制备  38-39
      2.11 免疫印迹分析AGO1 性别差异表达  39
    3 结果  39-52
      3.1 编码AGO1 基因全长cDNA 获得及生物信息学分析  39-45
      3.2 AGO1 基因转录期别差异分析  45
      3.3 AGO1 保守功能域和全长原核表达质粒的构建  45-47
      3.4 AGO1 保守功能域和全长的原核表达及蛋白纯化  47-51
      3.5 AGO1 多克隆抗体的制备及性别差异表达分析  51-52
    4 讨论  52-54
  第二章 日本血吸虫 AGO2 蛋白的研究  54-75
    1 材料  54-55
      1.1 实验动物  54
      1.2 主要试剂  54
      1.3 主要仪器  54-55
    2 方法  55-64
      2.1 EST 来源和RACE 引物  55
      2.2 总RNA 的提取  55
      2.3 RACE 扩增  55-60
      2.4 生物信息学分析  60
      2.5 AGO2 保守功能域原核表达载体的构建  60-62
      2.6 AGO2 保守功能域的原核表达  62-63
      2.7 重组蛋白的纯化  63
      2.8 AGO2 多克隆抗体的制备  63
      2.9 免疫印迹分析AGO2 性别和期别表达差异  63-64
    3 结果  64-74
      3.1 编码AGO2 基因全长cDNA 获得及生物信息学分析  64-69
      3.2 AGO2 保守功能域原核表达质粒的构建  69-71
      3.3 AGO2 保守功能域的原核表达及蛋白纯化  71-72
      3.4 AGO2 多克隆抗体的制备及性别期别差异表达分析  72-74
    4 讨论  74-75
  第三章 RNA 干扰 AGO1 基因影响其转录表达的研究  75-82
    1 材料  75-77
      1.1 实验动物  75
      1.2 主要试剂  75-76
      1.3 siRNA  76
      1.4 童虫培养基成分  76-77
      1.5 主要仪器  77
    2 方法  77-79
      2.1 兔红细胞的制备  77
      2.2 日本血吸虫14d 童虫的收集及体外培养  77-78
      2.3 荧光定量PCR 分析干扰效果  78
      2.4 免疫印迹分析干扰效果  78-79
    3 结果  79-80
      3.1 虫体成活率分析  79
      3.2 荧光定量PCR 分析干扰效果  79
      3.3 免疫印迹分析干扰效果  79-80
    4 讨论  80-82
参考文献  82-88
全文结论  88-89
攻读硕士学位期间发表的文章  89-90
致谢  90-91

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜寄生虫学
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