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小麦条锈菌毒性基因的RAPD标记及其ITS区序列分析研究

作　者: 赵杰
导　师: 康振生
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 植物病理学
关键词: 小麦条锈病小麦条锈菌毒性基因 RAPD rDNA-ITS 序列分析
分类号: S435.12
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

小麦条锈病是小麦生产上的一种重要病害。使用抗病品种是防治该病经济而有效的措施。然而,品种抗锈性丧失常导致小麦条锈病大发生,现已明确毒性变异是品种抗锈性丧失的主要原因。由于传统的毒性分析方法本身缺乏遗传标记,限制了对条锈菌群体进化和毒性变异机制的进一步认识,严重制约了小麦条锈菌群体生物学研究。目前,有关小麦条锈菌的毒性基因的分子标记尚未见报道,因此,利用DNA分子标记技术寻找小麦条锈菌毒性基因的特异性标记,在理论上和生产上均有重要的意义。本文拟采用RAPD分子标记技术,通过揭示小麦条锈菌水源11致病类型与Hybrid46致病类型的遗传多样性,寻找其特异性分子标记,这些标记很可能与毒性基因相关,从而为阐明病菌的毒性演化规律、开发更有效的病害防治方法及建立生理小种的快速分子检测体系奠定基础。本文取得了以下主要结果:对小麦条锈菌的RAPD反应条件进行了优化,建立了适于小麦条锈菌的RAPD反应体系。反应体系为:10×Reaction PCR Buffer 2.5 μl,MgCl2 2.0 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,引物 20 ng,模板DNA 40 ng,Taq酶 1U,ddH2O 补充至总体积25 μl。扩增程序为:94℃预变性5 min; 94℃, 30s, 36℃, 40s, 72℃, 90s, 45个循环;72℃延伸7 min。共选用了140条10碱基随机引物,分别对5个Hybrid46致病类型菌系和8个小麦条锈菌水源致病类型菌系进行了RAPD分析,结果获得了一个可能与小麦条锈菌Hybrid46致病类型毒性基因相关分子标记(HY-T1)、两个与水源11致病类型毒性基因相关的分子标记(Su-T1、Su-T2),三个片段(HY-T1、Su-T1、Su-T2)均克隆到pGEM-T easy vector上,测序结果表明HY-T1标记的DNA大小为1052 bp;Su-T1和Su-T2标记的DNA大小分别为554 bp和818 bp。序列同源性比较发现HY-T1第926～947处与人的受体蛋白基因第43356～43335处完全同源;Su-T1第336～357处与人的受体蛋白基因第47975～47996处完全同源;Su-T2第261～283处、第15～37处均与Ascochyta(壳二孢属)rabiei DNA处第98～120处完全同源,其潜在意义有待于进一步研究。采用通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)与ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC),对5个小麦条锈菌菌株、小麦秆锈菌和小麦叶锈菌rDNA的内转录区(ITS)进行PCR扩增,克隆、测序,从NCBI中搜索了一个已注册的小麦条锈菌(登录号:AY114292)序列,将其与参试菌株序列进行Alignment比较,绘制了菌株间亲缘关系系统树,Alignment分析结果表明:小麦条锈菌与小麦秆锈菌、小麦叶锈菌间的序列存在较大的差异。并根据序列差异性设计了一对小麦条锈菌的特异引物,以此引物对包括小麦条锈菌在内的7种小麦叶部病害病原进行了PCR检测,结果表明:在优化的反应体系下及扩增条件下此对引物只在小麦条锈菌为模板的扩增体系<WP=6>中扩出一条大小约为170 bp的扩增产物,为小麦条锈病的早期快速诊断及对病害的监测和预测预报有重要的应用价值。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-12
第一章文献综述  12-25
  1 小麦条锈病研究进展  12-13
    1.1 小麦条锈病的为害与分布  12
    1.2 小麦条锈菌研究  12-13
  2 小麦条锈菌的遗传多样性研究  13-15
    2.1 利用生化方法研究小麦条锈菌的遗传多样性  13-14
    2.2 利用分子生物学方法研究小麦条锈菌遗传多样性  14-15
  3 遗传多样性研究方法进展  15-21
    3.1 形态标记  15
    3.2 细胞学标记  15
    3.3 生化(同工酶)标记  15-16
    3.4 DNA分子标记  16-21
  4 RAPD标记在植物真菌病害研究中的应用  21-25
    4.1 在植物病原真菌的系统分类研究中的应用  21-22
    4.2 在植物病原真菌的群体遗传研究中的应用  22-23
    4.3 在植物病原真菌的毒性变异机制研究中应用  23
    4.4 在植物抗病性遗传育种中的应用  23-25
第二章小麦条锈菌特异性DNA扩增片段的筛选  25-33
  1 研究的目的意义  25
  2 材料与方法  25-33
    2.1 试验材料  25-28
      2.1.1 供试菌种的繁殖与鉴定  25-26
      2.1.2 试剂  26-27
      2.1.3 培养基  27
      2.1.4 仪器设备  27-28
    2.2 研究方法  28-33
      2.2.1 小麦条锈菌基因组DNA(gDNA)的提取  28
      2.2.2 小麦锈菌DNA样品浓度与纯度的测定  28
      2.2.3 小麦条锈菌PCR扩增产物电泳  28
      2.2.4 小麦条锈菌RAPD分析体系的优化  28-29
      2.2.5 与小麦条锈菌毒性基因连锁的RAPD标记的筛选  29
      2.2.6 目的条带的回收、纯化  29-30
      2.2.7 目的片段的克隆与鉴定  30-32
        2.2.7.1 CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞  30
        2.2.7.2 目的片段的连接反应  30-31
        2.2.7.3 转化  31
        2.2.7.4 质粒DNA的小量提取  31
        2.2.7.5 重组体的鉴定  31-32
      2.2.8 特异片段的测序  32-33
第三章结果与分析  33-40
  1 小麦锈菌DNA完整性验证结果  33
  2 小麦条锈菌RAPD分析体系的建立  33-35
    2.1 模板DNA浓度对RAPD的影响  33-34
    2.2 Mg2+浓度对RAPD的影响  34-35
    2.3 dNTPs浓度对RAPD的影响  35
    2.4 引物浓度对RAPD的影响  35
    2.5 Taq酶量对RAPD的影响  35
  3 目的片段的获得  35-36
  4 目的片段的回收  36
  5 克隆的获得与鉴定  36-38
    5.1 阳性克隆的挑选  36-37
    5.2 酶切鉴定  37
    5.3 PCR鉴定  37-38
  6 特异RAPD目的片段的序列测定及分析  38-40
第四章结论与讨论  40-43
  1 结论  40-41
  2 讨论  41-43
第五章小麦条锈菌的ITS区序列分析  43-56
  1 ITS标记及其在植物病原菌分子检测中的应用  43-44
  2 研究的目的意义  44
  3 材料与方法  44-45
    3.1 试验材料  44-45
      3.1.1 供试菌种  44
      3.1.2 基因组DNA(gDNA)的提取  44-45
      3.1.3 PCR扩增及产物检测  45
      3.1.4 目的条带的回收、纯化  45
      3.1.5 目的片段的克隆与鉴定  45
      3.1.6 DNA序列的测定  45
      3.1.7 特异引物设计  45
      3.1.8 特异性引物的PCR扩增及电泳检测  45
  4 结果与分析  45-54
    4.1 PCR反应体系、扩增条件的建立  45-46
    4.2 ITS区PCR扩增结果  46
    4.3 目的片段的回收  46-47
    4.4 克隆的获得与鉴定  47-54
      4.4.1 阳性克隆的挑选  47
      4.4.2 酶切鉴定  47
      4.4.3 PCR鉴定  47
      4.4.4 DNA ITS区序列分析  47-48
      4.4.5 特异引物的设计  48-54
      4.4.6 特异引物验证及检测结果  54
  5 结论与讨论  54-56
致谢  56-57
参考文献  57-62
附图  62-63
作者简介  63

小麦条锈菌毒性基因的RAPD标记及其ITS区序列分析研究

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