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低能N~+离子注入诱变的凤仙花突变体组织培养及其诱变机制分析

作　者: 谢璐
导　师: 高武军
学　校: 河南师范大学
专　业: 遗传学
关键词: 凤仙花低能N~+注入组织培养 ISSR RAPD 诱变效应
分类号: S681.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

凤仙花(Impatiens balsamine L.)属凤仙花科凤仙花属,是我国各地广泛分布的一种多年生常绿草本花卉。常见凤仙花多为单色,单瓣较多,重瓣花型简单,且花多为叶腋处着生,大大限制了凤仙花作为常规观赏花卉的充分开发利用。离子注入作为一种诱变技术已经在多种园艺植物的性状改良上获得了成功,通过合适剂量的低能N~+离子注入凤仙花的不同器官,可在诱变的后代中选育出更为符合需要的新品系。但是对于低能离子诱变的凤仙花的快速组织培养及快繁体系的建立以及突变机制的分析鲜见报道。本项目以低能N~+离子束诱导获得了稳定的粉色和红色凤仙花突变体为材料,利用组织培养技术初步建立了凤仙花突变体体细胞快繁体系。同时采用ISSR、RAPD分子标记技术对凤仙花的突变体和对照株的核基因组DNA标记进行扩增并克隆测序,并分析揭示低能N~+离子注入引起的凤仙花基因组变异机制。研究取得的主要结论如下:1、初步建立了凤仙花组织培养技术体系。确定了下胚轴诱导愈伤组织形成及继代的培养基为:MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L +3%蔗糖+0.5%琼脂;愈伤组织分化芽的培养基为:1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.05 mg/L;愈伤组织分化根的培养基为:MS+ NAA 0.5 mg/L+ 2.5%蔗糖+0.5%琼脂;经炼苗后移栽,初步获得了快繁幼苗。2、建立了凤仙花的ISSR反应体系,并将突变体和对照植株基因组进行了ISSR扩增,将获得的特异条带进行了克隆和测序分析。结果发现,从121条ISSR引物中筛选出了6条可以稳定扩增出特异条带的引物,引物多态性为4.96%,共扩增出46条特异带,其中红色突变体有18条,粉色突变体有28条。在克隆的红色凤仙花的ISSR条带中,共有55个位点发生了碱基突变;在克隆的粉色凤仙花的ISSR条带中,共有71个位点发生了碱基突变。对特异条带进行了克隆和测序,序列分析发现:红色诱变和粉色诱变的碱基变异的类型均包括碱基的转换、颠换、缺失、插入四种。在红色突变体中,碱基置换的频率(70.91%)显著高于碱基插入和缺失(29.09%)的频率,而在碱基置换中,颠换的频率(45.45%)是转换频率(25.45%)的1.79倍;在粉色突变体中,碱基置换的频率(76.05%)也显著高于碱基插入和缺失的频率(23.95%),而在碱基置换中,转换的频率(39.44%)接近颠换频率(36.62%)。通过对其碱基突变次数的研究,发现红色凤仙花突变体腺嘌呤(A)共发生22次突变,占总突变数的40.00%,说明腺嘌呤(A)对低能N~+离子具有较高的辐射敏感性;而粉色凤仙花突变体中胸腺嘧啶(T)共发生27次突变,占总突变数的38.03%,较其它三种碱基突变频率高,说明胸腺嘧啶(T)对低能N~+离子具有较高的辐射敏感性。3、建立了凤仙花的RAPD反应体系,并将突变体和对照植株基因组进行了RAPD扩增,将获得的特异条带进行了克隆和测序分析。结果发现,从208条RAPD引物中仅筛选出了6条可扩增出稳定特异条带的引物,其引物多态性仅为2.89%。共扩增出35条特异带,其中红色突变体和粉色突变体中分别为16和19条。在克隆的红色凤仙花突变体中,共有60个位点发生了碱基突变;在克隆的粉色凤仙花突变体中共有53个位点发生了碱基突变。对特异条带进行了克隆和测序,序列分析发现:红色诱变和粉色诱变的碱基突变类型均包括碱基的转换、颠换、缺失、插入四种。在红色突变体中,碱基置换的频率(73.33%)高于碱基插入和缺失的频率(26.67%),而在碱基置换中,转换的频率(40.00%)接近颠换频率(33.33%);在粉色突变体中,碱基置换的频率(90.57%)显著高于碱基插入和缺失的频率(9.43%),而在碱基置换中,转换的频率(64.15%)接近颠换频率(26.42%)的2.43倍。通过对其碱基突变次数的研究,发现红色凤仙花突变体腺嘌呤(A)共发生26次突变,占总突变数的43.33%,说明腺嘌呤(A)对低能N~+离子具有较高的辐射敏感性;而粉色凤仙花突变体的胸腺嘧啶(T)共发生20次突变,占总突变数的37.74%,说明胸腺嘧啶(T)对低能N~+离子具有较高的辐射敏感性。这与通过ISSR技术研究的结果相一致。4、通过ISSR和RAPD技术对低能N~+离子注入凤仙花突变体基因组变异的综合分析发现,低能N~+离子注入引起凤仙花基因组发生了碱基转换、颠换、缺失和插入突变。总碱基突变率为0.63%,在总数为239个突变碱基中,单碱基置换频率为77.40%,显著高于缺失(13.81%)和插入(8.79%)突变。在碱基置换中,转换(100次)和颠换(85次)出现次数无显著差异,A/T颠换频率占到总颠换频率的47.06%,显著高于其它颠换类型。在插入和缺失突变中,四种碱基均出现频率较低的变异。因此,低能N~+离子注入主要引起凤仙花基因组发生了单碱基置换。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
缩略语表（Abbreviation）  9-12
1 前言  12-24
  1.1 人工诱变技术在植物中的应用  12-15
  1.2 离子注入技术在植物诱变中的应用  15-17
  1.3 人工诱变植物材料的繁殖和保存  17-19
  1.4 人工诱变植物突变体的诱变效应  19-20
  1.5 凤仙花的人工诱变研究概况  20-22
  1.6 立题依据及意义  22-24
2 材料与方法  24-30
  2.1 材料  24-26
    2.1.1 植物材料  24
    2.1.2 主要试剂  24-25
    2.1.3 实验用主要溶液及培养基组成  25-26
  2.2 方法  26-30
    2.2.1 凤仙花突变体组织培养体系建立  26-27
    2.2.2 N~+ 离子注入凤仙花诱变效应分析  27-30
3 结果与分析  30-58
  3.1 凤仙花突变体组织培养体系建立  30-35
    3.1.1 不同灭菌方法对凤仙花种子灭菌效果的影响  30-31
    3.1.2 不同生长调节剂组合对凤仙花突变体下胚轴愈伤组织诱导的影响  31-32
    3.1.3 不同生长调节剂对凤仙花愈伤组织芽分化的影响  32-34
    3.1.4 不同生长调节剂对凤仙花芽生根的影响  34
    3.1.5 凤仙花试管苗炼苗与移栽  34-35
  3.2 凤仙花突变体ISSR 分子标记技术体系建立及诱变机制分析  35-47
    3.2.1 凤仙花突变体ISSR 反应体系的优化  35-36
    3.2.2 凤仙花突变体ISSR 扩增引物的筛选  36-37
    3.2.3 红色凤仙花突变体ISSR 扩增特异条带的克隆与测序  37-42
    3.2.4 粉色凤仙花突变体ISSR 扩增特异条带的克隆与测序  42-47
  3.3 凤仙花突变体RAPD 分子标记技术体系建立及诱变机制分析  47-58
    3.3.1 凤仙花RAPD 反应体系的优化  47-48
    3.3.2 凤仙花突变体RAPD 扩增引物的筛选  48-49
    3.3.3 红色凤仙花突变体RAPD 扩增特异条带的克隆与测序  49-53
    3.3.4 粉色凤仙花突变体RAPD 扩增特异条带的克隆与测序  53-58
4 讨论  58-62
  4.1 N~+ 离子注入凤仙花突变体及对照基因组变异特征  58-59
  4.2 N~+ 离子注入凤仙花诱变效应机制  59-62
5 结论  62-64
参考文献  64-72
致谢  72-74
攻读学位期间发表的学术论文目录  74-75

低能N~+离子注入诱变的凤仙花突变体组织培养及其诱变机制分析

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