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中华绒螯蟹精子膜蛋白的提取分离及部分生化性质研究

作　者: 程立均
导　师: 康现江
学　校: 河北大学
专　业: 水生生物学
关键词: 中华绒鳌蟹精子膜蛋白糖蛋白 SDS一PAGE 超微结构生化性质
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

成熟精子的质膜表面含有多种蛋白，有些是精子本身所固有的，有些是在精子成熟过程中黏附到精子表面的，这些精子膜蛋白在维持精子形态结构完整、完成精子的新陈代谢和生殖功能中发挥着重要的作用，特别是与精卵识别、结合以及质膜融合等受精活动密切相关。本文以我国重要的淡水养殖珍品——中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)为实验材料，从提取、分离、生化性质分析等几个方面对精子膜蛋白进行了初步的研究。首先，通过分级分离和比较电泳的方法对中华绒螯蟹精荚各部分的蛋白组分进行分析，并在试验过程中，建立起一套精荚分级分离的方法，通过电泳分析和透射电镜观察等手段对这一方法的可行性进行了验证。其次，利用超声波匀浆和蔗糖密度梯度离心的方法对中华绒螯蟹的精子膜进行了分离纯化，并利用透射电镜技术对精子膜分离纯化的效果进行了研究。最后，利用去污剂溶脱的方法从中华绒螯蟹精子膜表面提取得到膜蛋白，并对其部分生化性质进行研究。实验结果显示，通过分级分离所得的精液、精荚基质和纯品精子等各个部分，在SDS-PAGE电泳图谱上均显示出不同的特征性谱带，且试验的重复性较好，证明本实验建立的精荚分级分离的方法是可行的。对精液、精荚基质蛋白组分的PAS糖蛋白染色结果显示，精液中主要的蛋白组分均为糖蛋白，共有3种；精荚基质中有2种主要的蛋白组分是糖蛋白。这一实验结果与精液的营养功能一致，同时也表明，精荚基质除了对精子具有保护作用外，还可能含有精子在其中进行新陈代谢所需要的营养物质。通过对精荚和分级分离得到的精子样品进行透射电镜观察，研究发现，分级分离所得的精子绝大多数形态结构未发生变化，质膜结构保持完整，这一结果进一步证明了通过分级分离方法获取精子的可行性，也为接下来的膜蛋白提取研究奠定了基础。另外，利用超声波匀浆和蔗糖密度梯度离心法成功地纯化得到了中华绒螯蟹的精子膜，经透射电镜观察发现，所得的精子膜均一性很好。使用含1％ TritonX-100和少量SDS的膜蛋白提取缓冲液对中华绒螯蟹精子膜蛋白进行溶脱提取，对所得的膜蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳分析，结果显示，中华绒螯蟹的精子至少含有11种不同的膜多肽组分。对这些精子膜摘要蛋白组分的部分生化性质进行分析，结果表明，中华绒鳌蟹精子膜蛋白是一组具酸性等电点的低分子量糖蛋白，分子量在38ku一83ku之间，等电点在4.8左右。本文在中华绒鳌蟹精子膜的分离纯化，精子膜蛋白的提取分离，及其生化性质的测定分析等方面进行了初步的研究和探索，各种精子膜蛋白在受精过程中的具体作用，仍有待于进一步的研究。

全文目录

第1章绪论  11-20
  1.1 研究现状  11-18
    1.1.1 中华绒螯蟹的雄性生殖系统  11-13
    1.1.2 精子膜蛋白  13-18
  1.2 研究目的和意义  18-20
第2章中华绒螯蟹精荚各部分的分级分离及蛋白组分分析  20-27
  2.1 引言  20
  2.2 材料与方法  20-22
    2.2.1 材料  20
    2.2.2 仪器  20
    2.2.3 方法  20-22
      2.2.3.1 精荚各部分的分级分离  20-21
      2.2.3.2 精荚各部分的蛋白组分分析  21
      2.2.3.3 精子总蛋白电泳的复合银染  21-22
      2.2.3.4 精液、精荚基质的糖蛋白检测  22
  2.3 结果  22-24
    2.3.1 精荚各部分的分级分离  22
    2.3.2 精荚各部分的蛋白组分分析  22-23
    2.3.3 精液、精荚基质的糖蛋白检测  23-24
  2.4 讨论  24-27
第3章中华绒螯蟹精子脱膜及透射电镜观察  27-32
  3.1 引言  27
  3.2 材料与方法  27-29
    3.2.1 材料  27
    3.2.2 仪器  27-28
    3.2.3 方法  28-29
      3.2.3.1 精子的获得  28
      3.2.3.2 精子膜的分离  28
      3.2.3.3 精子膜的纯化  28
      3.2.3.4 透射电镜样品的制备与观察  28-29
  3.3 结果  29-30
    3.3.1 精荚中的精子  29
    3.3.2 分级分离得到的精子  29
    3.3.3 超声波匀浆后的精子  29-30
    3.3.4 纯化的精子膜  30
  3.4 讨论  30-32
第4章中华绒螯蟹精子膜蛋白的提取  32-39
  4.1 引言  32
  4.2 材料与方法  32-34
    4.2.1 材料  32
    4.2.2 仪器  32
    4.2.3 方法  32-34
      4.2.3.1 精子的收集  32-33
      4.2.3.2 精子膜蛋白的提取  33
      4.2.3.3 膜蛋白的含量测定  33-34
      4.2.3.4 SDS-PAGE鉴定  34
  4.3 结果  34-37
    4.3.1 膜蛋白提取缓冲液的最佳TritonX-100浓度  34
    4.3.2 膜蛋白提取缓冲液的最佳添加体积  34-35
    4.3.3 膜蛋白的含量  35-36
    4.3.4 SDS-PAGE鉴定  36-37
  4.4 讨论  37-39
    4.4.1 膜蛋白提取的缓冲系统  37
    4.4.2 膜蛋白含量的测定方法  37-38
    4.4.3 精荚、精子的冷冻保存  38-39
第5章中华绒螯蟹精子膜蛋白部分生化性质的研究  39-44
  5.1 引言  39
  5.2 材料与方法  39-40
    5.2.1 材料  39
    5.2.2 仪器  39
    5.2.3 方法  39-40
      5.2.3.1 分子量的测定  39
      5.2.3.2 糖蛋白的检测  39-40
      5.2.3.3 等电点范围的测定  40
  5.3 结果  40-42
    5.3.1 精子膜蛋白的分子量  40-41
    5.3.2 糖蛋白的检测  41-42
    5.3.3 精子膜蛋白的等电点范围  42
  5.4 讨论  42-44
第6章结语  44-45
参考文献  45-51
图版  51-54
致谢  54-55
附录  55-56
  (一) 一些重要试剂的配制  55-56
  (二) 个人简介及已发表的论文  56

中华绒螯蟹精子膜蛋白的提取分离及部分生化性质研究

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