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骨髓间充质干细胞分离培养及其向肿瘤局部归巢机制的初步探索

作　者: 纪腾
导　师: 马丁
学　校: 华中科技大学
专　业: 妇产科学
关键词: 骨髓间充质干细胞肿瘤血管内皮细胞细胞培养及鉴定肿瘤归巢 Snail 宫颈癌上皮细胞间质化转变(EMT) 上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

【研究背景及目的】骨髓间充质干细胞是一类具有多能分化潜能的细胞,可以向骨组织,心肌,软骨组织,肌肉等分化,并且可以特异迁移到损伤部位及肿瘤局部,被认为是具有应用前景的基因治疗细胞载体。然而,间充质干细胞靶向归巢肿瘤局部的机制却不太清楚。本研究在于分离人类骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),并探讨其体内靶向归巢肿瘤局部的机制。【方法】(1)密度梯度离心法获得骨髓间充质干细胞,并体外培养扩增。(2)流式细胞仪及激光共聚焦显微镜检测骨髓间充质干细胞表面标志分子CD44、CD105、CD90、CD34、CD45、CD19;不同条件培养基诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化、软骨分化及脂肪分化,倒置显微镜观察。(3)建立小鼠原位乳腺肿瘤模型,尾静脉注射菲力磁(SPIO)体外标记的骨髓间充质干细胞,利用冰冻切片对骨髓间充质干细胞在小鼠肿瘤局部的分布情况进行检测。(4)取新鲜乳腺癌组织,剪碎,胶原酶消化成单细胞悬液,细胞标记抗CD31单克隆抗体,免疫磁柱分离抗CD31单克隆抗体阳性细胞,即肿瘤血管内皮细胞,并且体外原代培养。(5)流式细胞仪及激光共聚焦显微镜检测肿瘤血管内皮细胞标志性分子CD31、CD34、vWF。(6)Transwell模型验证肿瘤细胞对间充质干细胞的体外趋化能力。(7)Transwell模型血管内皮细胞对骨髓间充质干细胞体外趋化能力,结晶紫染色,显微镜照相,每个滤膜随机选取5个200倍视野计数穿膜细胞数,穿膜细胞数表示骨髓间充质干细胞的体外迁移能力。【结果】(1)原代贴壁细胞呈长梭形。体外培养一周,细胞形态均一,扩增速度快,克隆形成能力强。(2)流式细胞仪检测发现骨髓间充质干细胞表面分子标志物CD44、CD105、CD90阳性率分别为99.79±3.35% , 99.62±3.78%,98.93±3.62%,阴性标志物CD34、CD45、CD19为4.32±1.01%,4.04±1.05%,6.04±0.95%;激光共聚焦显微镜下,可见骨髓间充质干细胞阳性标志物在细胞内存在较高表达。不同的条件培养液成功诱导骨髓间充质干细胞向骨组织、脂肪组织及软骨组织分化,验证了骨髓间充质干细胞多向分化潜能。(3)体外SPIO标记的骨髓间充质干细胞通过尾静脉注射到荷瘤小鼠体内,细胞主要聚集在肿瘤局部。(4)免疫磁珠方法分离的肿瘤血管内皮细胞,6-12小时贴壁生长,早期细胞呈小多角、球形,逐渐生长成梭形,于3～4d后融合,为单层呈铺路石状排列。(5)流式细胞仪检测发现,CD31、CD34、vWF阳性率分别为92.8±2.32%,99.87±1.95%,86.26±2.57%(6)Boyden小室结果显示:在相同时间点,下室接种MDA -MB-231及MDA -MB-435s细胞组与对照组相比,穿膜细胞数无明显改变。(7)Boyden小室结果显示:肿瘤血管内皮细胞组,骨髓间充质干细胞穿膜细胞数明显多于对照组(p﹤0.05)【结论】体外可获得较高纯度的骨髓间充质干细胞,且易于培养扩增。骨髓间充质干细胞体内靶向归巢肿瘤局部的能力与肿瘤局部血管内皮细胞有关。目的:研究Snail与宫颈癌侵袭转移间的关系,并探讨其分子机制。方法:构建正义全长Snail真核表达载体并转染宫颈癌细胞系Hela、Siha。采用Western blot方法分析相关基因表达,细胞伤痕愈合实验,Transwell模型穿膜细胞计数检测细胞侵袭转移能力。结果:(1)在转染PEGFPC1/Snail的宫颈癌细胞株Hela、SiHa中E-cadherin表达明显下调,Snail和Vimentin则表达上调(p<0.05)。(2)宫颈癌细胞系Hela、Siha转染正义全长Snail真核表达载体,12小时细胞伤痕愈合能力显著提高(p<0.05);转染PEGFPC1/Snail后,Hela、SiHa细胞12小时穿膜细胞数明显增多(p<0.05)。Snail过表达可显著促进宫颈癌细胞株Hela、SiHa的侵袭转移潜能。结论:转录因子Snail促进宫颈癌上皮细胞间质化转变(EMT)并提高其侵袭转移能力。

全文目录

第一部分：骨髓间充质干细胞分离培养及其向肿瘤局部归巢机制的初步探索  5-33
  中文摘要  5-7
  英文摘要  7-10
  前言  10-11
  实验材料与方法  11-20
  实验结果  20-27
  讨论  27-29
  参考文献  29-33
第二部分：Snail 对宫颈癌细胞侵袭转移的影响  33-43
  中文摘要  33-34
  英文摘要  34-35
  前言  35
  实验材料与方法  35-37
  实验结果  37-40
  讨论  40-41
  参考文献  41-43
第三部分：综述  43-55
  参考文献  47-55
致谢  55-56

骨髓间充质干细胞分离培养及其向肿瘤局部归巢机制的初步探索

内容摘要

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