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新城疫病毒F48E9株全基因组核苷酸序列测定及表达载体构建

作　者: 闫丽辉
导　师: 刘宝全
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 新城疫病毒 F48E9株全基因组序列测定全基因组表达载体构建遗传变异分析
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

为了深入研究NDV的结构和功能、构建NDV感染性克隆，本论文对中国标准强毒F48E9株的全基因组cDNA进行了分段克隆，并测定了全基因组核苷酸序列。然后根据基因组的核苷酸序列，将其亚克隆到低拷贝表达载体pX8dT上，并使之位于T7 RNA聚合酶启动子和自催化的丁型肝炎病毒核酶之间，从而为将来获得感染性cDNA奠定了物质基础。本实验首先参照国外已发表的NDV La Sota序列和已有的F48E9基因片段序列，应用Oligo(6.0)分析软件设计并合成了8对引物(F1、F2、F3、F4、F5、F6、3’、5’)和2条用于扩增5’和3’端的反转录引物(3’RT和5’RT)，利用RT-PCR方法分别扩增F48E9株NP、P、M、F+HN、L基因及3’端和5’端cDNA，并将其克隆到pMD18-T载体上；经限制性内切酶分析、质粒PCR鉴定以及序列测定，证明我们获得了含有新城疫病毒F48E9株全长基因组分段克隆阳性重组子p3、pM1、pM2、pM3、pM4、pLA、pLB和p5。然后对阳性重组子进行核苷酸序列测定，根据测得的序列设计并合成11条引物，利用PCR和限制性内切酶的方法将F48E9株全基因组分段的阳性重组子从克隆载体上亚克隆下来，并按顺序依次连接到低拷贝表达载体pX8dT上，采用Sanger’s双脱氧末端终止法进行测序，并应用DNASIS(Ver2.6)和DNASTAR分析软件将测序结果与新城疫病毒La Sota、Clone30、ZJ1、V4(HB92)和B1株的全基因组序列进行比较分析。实验结果表明：F48E9全基因组具有15192个碱基，比La Sota、V4、B1和Clone30的全基因组序列长6个碱基，和鹅源ZJ1株的长度相等。序列比较发现F48E9株在相应于La Sota基因组的1647—1648(NP-P基因间隔区)的位置处有6个碱基的插入。为了验证该6个碱基是否只存在于强毒株及其与毒力的关系，我们又设计一对引物X1和X2。通过RT-PCR方法扩增获得了另外10个背景清楚毒株的NP-P基因间隔区片段，将这些序列与F48E9、La Sota、Clone30、B1、ZJ1和V4的相应序列进行了比较，结果在参比的16个NDV毒株中在该区段中除了有多个点突变外，个别毒株有碱基插入和缺失，所有以La Sota株为代表的弱毒株均无6碱基的插入，而以F48E9株为首的强毒株均有此6碱基的插入，但有一个中等毒力的毒株DP没有6碱基的插入，不过它的基因序列和La Sota的几乎相同，对于所克隆到的基因的代表性还有待确定。因此6碱基插入与新城疫病毒的毒力相关，但最后的确定还有待于做更深入的研究，至于是否与病毒的其它生物学特性有关还要做进一步的研究。值得注意的是：通过序列比较我们发现我国标准强毒F48E9株基因组cDNA5’端1705-1722bp处有一个5’TCTCTCTCCTCTCTCCTCC3’的一个特殊序列，现在还无证据说明它与病毒之间的关系及其功能。此外，F48E9株L基因除了编码一个含有2204个氨基酸多肽外，还可编码一个52个氨基酸的疏水多肽，而NDV鸡源V4(HB92)株和鹅源分离株ZJ1的L基因不编码这个小蛋白。东北农业大学农学硕士学位论文一对六株NDV分离株全长基因组核音酸同源性进行比较发现，F48E9株与 La Sota、Clone30、ZJI、V4和BI的核昔酸同源性分别为：87．3％、87．7％、85．4％、88．8％和87．3％。这说明除了裂解位点以外NDV强弱毒之间仍存在着较大的差异，其中可能存在许多我们尚不知晓的重要结构，因此仅依赖中等毒力、弱毒株和无毒株的感染性克隆来研究NDV分子生物学特性、病毒的复制、致病机理、以及病毒和宿主之间的相互作用是远远不够的，构建强毒株的感染性分子克隆才是阐明NW致病机理更为有利的工具。本研究成功地获得了 NDV F48E9 ＄t＄因组的核昔酸序列，并构建了表达NDV F48E9基因组CDNA的低拷贝表达载体休－F48E9，为构建新城疫病毒强毒株F48E9株的感染性CDNA奠定了物质基础，进一步研究NDV的生物学特性、结构与功能的关系；进一步探讨影响NDV毒力的因素、以及研制新型疫苗载体提供了可靠保证。

全文目录

中文摘要  10-12
英文摘要  12-14
1 引言  14-29
  1．1 新城疫病毒分子生物学概述  14-20
  1．2 RNA病毒反遗传操作研究进展  20-23
  1．3 新城疫病毒反遗传操作技术研究进展  23-29
2 材料与方法  29-38
  2．1 试验材料  29-30
    2．1．1 病毒  29
    2．1．2 载体  29
    2．1．3 菌株与质粒  29
    2．1．4 实验动物  29
    2．1．5 主要试剂  29
    2．1．6 主要仪器  29-30
  2．2 方法  30-38
    2．2．1 病毒的增殖  30
    2．2．2 NDV F48E9株RNA的提取  30
    2．2．3 NDV F48E9株全基因组的RT-PCR扩增  30-32
    2．2．4 NDV F48E9株全基因组分段克隆  32-33
    2．2．5 阳性重组子的筛选与鉴定  33-34
    2．2．6 NDV F48E9株cDNA低拷贝表达载体的构建  34
    2．2．7 序列比较  34-35
    2．2．8 NP-P基因间隔区序列测定  35-38
3 实验结果  38-53
  3．1 NDV F48E9株全基因组cDNA克隆  38-40
    3．1．1 NDV F48E9株各基因的RT-PCR扩增  38
    3．1．2 NDV F48E9株3’端和5’端的RT-PCR扩增  38
    3．1．3 NDV F48E9株主要基因cDNA的克隆与鉴定  38-39
    3．1．4 NDV F48E9株全基因组cDNA核苷酸序列测定  39-40
  3．2 F48E9株全基因组cDNA低拷贝表达载体的构建  40-44
    3．2．1 F48E9株基因组3’端亚克隆结果  40-41
    3．2．2 F48E9株基因组3’端和NP基因的连接  41
    3．2．3 F48E9株3’端+NP+P连接  41
    3．2．4 F48E9株3’端+NP+P+M连接  41-42
    3．2．5 F48E9株L基因与5’端cDNA的连接  42
    3．2．6 F48E9株基因组全长cDNA低拷贝表达载体的构建  42-44
    3．2．7 F48E9株全基因组的核苷酸序列测定  44
  3．3 序列比较  44-50
    3．3．1 同源性比较  44-45
    3．3．2 F基因遗传变异分析  45-48
    3．3．3 HN基因遗传变异分析  48-49
    3．3．4 L基因遗传变异分析  49-50
  3．4 NP-P基因间隔区序列测定  50-53
    3．4．1 NP-P基因间隔区序列RT-PCR扩增及鉴定结果  50
    3．4．2 NP-P基因间隔区序列比较结果  50
    3．4．3 NP-P基因间隔区序列核苷酸序列同源性比较  50-53
4 讨论  53-59
  4．1 F48E9全基因组cDNA核苷酸序列  53
  4．2 NDV分离株同源性比较  53-54
    4．2．1 六株NDV分离株编码基因的核苷酸及氨基酸同源性比较  53
    4．2．2 F48E9株与其它毒株基因组核苷酸同源性比较  53-54
  4．3 NP-P基因间隔区6碱基的插入  54
  4．4 F基因遗传变异分析  54-56
    4．4．1 F蛋白裂解位点处氨基酸的组成与毒力直接相关  55
    4．4．2 不同NDV毒株F蛋白的糖基化位点稍有变化  55
    4．4．3 不同毒株半胱氨酸残基（Cys）的数目与位置有所差异  55-56
  4．5 HN基因遗传变异分析  56-57
    4．5．1 糖基化位点的变化  56
    4．5．2 半胱氨酸数目的变化  56-57
  4．6 L基因遗传分析  57
  4．7 基因起始与终止信号的序列比较  57-58
  4．8 方法学上的改进  58-59
    4．8．1 F48E9株3’端RT-PCR  58
    4．8．2 不同连接策略的比较  58-59
5 结论  59-60
参考文献  60-69
附录  69-90
攻读学位期间发表文章情况  90-91
致谢  91-92
作者简历  92

新城疫病毒F48E9株全基因组核苷酸序列测定及表达载体构建

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