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新城疫病毒陕西株的分离鉴定及其F基因的序列分析

作　者: 樊荣
导　师: 杨增岐
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 新城疫病毒 F基因克隆及序列分析
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

新城疫病毒（Newcastle disease virus , NDV）是副粘病毒科（Paramyxoviridae）副粘病毒亚科（Paramyxovirinae）腮腺炎病毒属（Rubulavirus）的成员,是禽Ⅰ型副粘病毒（APMV-1）的代表株,可以引起禽类的急性、高度接触性、致死性传染病。新城疫病毒为有囊膜的负链RNA病毒,可存在于病禽所有组织器官、体液、分泌物和排泄物中。经过多年的综合防制,我国虽已基本控制了该病的流行,但近几年ND的流行出现新的特点,即非典型ND病例日益增多,甚至很多高抗体鸡群仍然发病。许多学者认为这些新的流行特点很可能是由毒株变异引起。因此对新城疫病毒的病原研究和新型疫苗的开发显更为重要。本研究通过对8株NDV分离株F基因的扩增和序列分析,探讨分离毒株相互之间以及与疫苗毒之间的遗传进化关系,目的是从分子水平上分析我国新城疫疫苗免疫失败的原因。研究内容如下:本研究通过鸡胚分离病毒,结合血清学鉴定,从来自陕西地区的疑似ND病料中分离鉴定出8株NDV。这些毒株跨度为2007～2008年间,分离自鸡（3株）、朱鹮（1株）、鸽（3株）、鸵鸟（1株）。分别测定了其生物学特性,包括鸡胚半数致死量（ELD50）、脑内致病指数（ICPI）、鸡胚最小致死量的平均死亡时间（MDT）的测定,毒力测定结果表明:除鸡NDV分离株外,鸽源NDV分离株、鸵鸟NDV分离株及朱鹮 NDV分离株均为速发型强毒株;应用RT-PCR方法对8个NDV分离株（Sh-1、Sh-2、Sh-3、Sh-3、Sh-4、Sh-5、Sh-6、Sh-7、Sh-8）的F基因主要功能片段进行了扩增,各产物经克隆、测序后与GenBank登录NDV参考毒株的F基因进行核苷酸及推导氨基酸序列分析。结果表明,8个NDV分离毒株间的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸同源性分别在85.0 %～99.3 %和88.6 %～99.1 %;分离毒株与参考毒株的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸序列同源性分别为85.0 %～99.4 %和89.7 %～99.4 %;Sh-1、Sh-2、Sh-3、Sh-6、Sh-8分离毒株F蛋白的裂解位点均为¹¹²R-R-Q-K-R-F¹¹⁷,符合强毒株的分子特征;Sh-4、Sh-5、Sh-7分离毒株分离自鸡,其F蛋白的裂解位点均为¹¹²G-R-Q-G-R-L¹¹⁷,符合弱毒株的分子特征。试验结果提示3个鸽源分离株可能是同一毒株在传播过程中发生的变异,且与疫苗株在分子水平上的同源性较低;三株鸡NDV分离株与国内新城疫传统疫苗株Lasota、B1株核苷酸和氨基酸的同源性较高,分别在98.1 %～99.4 %、93.5 %～99.6 %,结果提示该3株毒株可能是疫苗株在传播过程发生的变异。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
第一章新城疫病毒和新城疫疫苗的研究进展  9-26
  1.1 新城疫病毒的一般生物学特性  9-13
    1.1.1 NDV 的分类地位  9
    1.1.2 NDV 的基因组结构  9-10
    1.1.3 NDV 的形态学特征和理化特性  10
    1.1.4 NDV 的生物学特性  10-12
    1.1.5 NDV 的抗原性和基因型  12-13
  1.2 新城疫病毒的流行病学特性  13-17
    1.2.1 NDV 的宿主范围  13-14
    1.2.2 NDV 的传播途径和流行方式  14
    1.2.3 NDV 的流行现状  14-17
  1.3 ND 的诊断  17-20
    1.3.1 病原的分离与鉴定  17
    1.3.2 新城疫病毒的分离  17
    1.3.3 培养系统  17
    1.3.4 血清学检测技术  17-18
    1.3.5 现代分子生物学检测技术  18-20
  1.4 NDV 的免疫  20-22
    1.4.1 NDV 的免疫基础  20-21
    1.4.2 NDV 的体液免疫  21
    1.4.3 细胞免疫  21
    1.4.4 局部免疫  21-22
    1.4.5 被动免疫  22
  1.5 新城疫疫苗  22-26
    1.5.1 常规疫苗  22-23
    1.5.2 基因工程疫苗  23-26
第二章新城疫病毒陕西株的分离与鉴定  26-32
  2.1 试验材料  26-27
    2.1.1 病料采集  26
    2.1.2 非免疫鸡胚及试验鸡  26
    2.1.3 病毒、阳性血清  26
    2.1.4 主要实验仪器、试剂和耗材  26-27
  2.2 试验方法  27-29
    2.2.1 NDV 的分离和增殖  27
    2.2.2 血凝试验（HA）和血凝抑制试验（HI）  27-28
    2.2.3 病毒的生物学特性  28-29
    2.2.4 动物回归试验  29
  2.3 试验结果  29-30
    2.3.1 NDV 的分离鉴定  29-30
      2.3.1.1 鸡胚接种及病变观察  29
      2.3.1.2 HA 和 HI 结果  29-30
    2.3.2 病毒的生物学测定结果  30
  2.4 讨论  30-32
第三章新城疫陕西分离株F 基因的克隆与分子遗传变异分析  32-49
  3.1 实验材料  32-33
    3.1.1 主要试验仪器  32
    3.1.2 主要试剂和耗材  32-33
  3.2 试验方法  33-37
    3.2.1 常用试剂的配制  33-34
    3.2.2 主要试剂  34
    3.2.3 病毒的RT-PCR 鉴定  34-35
    3.2.4 各分离毒株的核苷酸序列测定及其分子遗传变异分析  35-37
  3.3 结果与分析  37-46
    3.3.1 病毒的RT-PCR 扩增  37-38
    3.3.2 重组质粒的鉴定  38
    3.3.3 核苷酸序列测定  38-43
    3.3.4 NDV 分离株 F 基因的分子特性分析  43-46
  3.4 讨论  46-49
结论  49-50
参考文献  50-55
缩略词  55-56
氨基酸的缩写  56-57
致谢  57-58
作者简介  58

新城疫病毒陕西株的分离鉴定及其F基因的序列分析

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