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印记基因SNRPN rs220030多态性及亲源差异性甲基化状态的研究

作　者: 赵贇
导　师: 赵子琴
学　校: 复旦大学
专　业: 法医学
关键词: 单核苷酸多态性(SNP) SNRPN rs220030 亲源差异性甲基化 MS-SSCA
分类号: D919
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：选择印记基因SNRPN启动子区域内的SNP位点rs220030,利用TaqMan SNP分型技术分析其多态性,统计多态性参数；评价电泳技术在SNPs分型及等位基因亲源差异性甲基化状态研究中的应用前景；建立实用、简便的MS.SSCA法分析杂合子家系样本中等位基因的亲源差异性甲基化状态,评价其法医学潜在应用价值,为解决法医生物学实践检案中的难点提供新的思路和解决方法。方法：通过公共信息数据库初步筛选得到SNP位点rs220030,通过TaqMan SNP Genotyping Assay对300名上海地区无关汉族健康人群该位点进行分型并分析其遗传多态性；对实验中微量血痕样品建立可靠的重亚硫酸盐修饰方法；通过DGGE技术分析家系样品rs220030位点的多态性；通过MS-SSCA法分析该位点在4对杂合子家系样本中等位基因的亲源差异性甲基化状态。结果：通过TaqManSNP分型,得到300名上海地区无关汉族健康人群rs220030位点的等位基因频率及遗传多态性参数；成功建立起法医微量血痕DNA样品的重亚硫酸盐修饰法；DGGE电泳技术可准确地对rs220030位点进行多态性分析；最后,通过MS-SSCA检测了杂合子家系样品中该位点等位基因“母源印记”甲基化状态,判断出孩子样品等位基因的亲代来源。结论：得到rs220030位点的等位基因频率及遗传多态性参数,该位点若结合其他SNPs,则具有法医生物学应用价值；经典DGGE电泳技术可进行简便、高效的SNP单位点多态性分析；经重亚硫酸盐修饰后的微量血痕DNA样品可用于后续甲基化分析研究,且结合MS-SSCA方法可判断印记基因SNPs位点的等位基因的亲代来源,分析其亲源差异性甲基化状态,在法医生物学中具有良好的应用前景。

全文目录

英文缩略词表  7-8
摘要  8-9
Abstract  9-10
月Jl青  10-13
第一部分:印记基因SNRPN启动子区域SNP位点选择  13-18
  1 SNP位点的筛选原则  13-14
  2 SNP位点的筛选方法  14-15
    2.1 通过SNPs Finder、HapMap初步筛选位点  14-15
    2.2 遗传学多态性参数计算公式  15
  3 SNP位点筛选结果  15-17
    3.1 初筛及同源性检查结果  15-16
      3.1.1 初筛结果  15-16
      3.1.2 同源性检查结果  16
    3.2 多态性参数结果  16-17
  讨论  17-18
第二部分:rs220030位点Taqman SNP Genotyping分型及结果分析  18-24
  材料和方法  18-21
    1 血痕样本的收集制备  18
    2 实验主要仪器和试剂  18-19
      2.1 主要仪器  18-19
      2.2 主要试剂  19
    3 实验方法  19-21
      3.1 微量血痕样本DNA抽提  19-20
      3.2 DNA样品浓度、OD值检测  20
      3.3 TaqMan SNP Genotyping Assay分型  20-21
    4 分型结果分析方法  21
      4.1 rs220030位点频率分布统计  21
      4.2 遗传多态性参数的统计分析方法  21
  结果  21-23
    1 DNA样品浓度、OD值检测结果  21
    2 TaqMan分型结果  21-22
    3 等位基因频率分布结果  22
    4 遗传多态性参数计算结果  22-23
  讨论  23-24
第三部分:建立微量血痕DNA样品重亚硫酸盐修饰法  24-34
  材料和方法  24-29
    1 血痕样本的收集制备  24
    2 实验主要仪器和试剂  24-25
      2.1 主要仪器  24-25
      2.2 主要试剂  25
    3 实验方法  25-29
      3.1 微量血痕样本DNA抽提  25-26
      3.2 DNA样品浓度、OD值检测  26
      3.3 1%琼脂糖电泳  26
      3.4 重亚硫酸盐修饰微量血痕DNA样品  26-27
      3.5 甲基化特异性PCR(MSP)  27
      3.6 MSP产物琼脂糖电泳及胶回收测序  27-29
      3.7 MSP测序结果与SNRPN DMR原始序列对比分析  29
  结果  29-32
    1 微量血痕DNA抽提结果分析  29-31
      1.1 1%琼脂糖电泳结果  29-30
      1.2 DNA样品浓度、OD值检测结果  30-31
    2 MSP结果  31-32
    3 SNRPN DMR MSP测序结果与原始序列对比分析结果  32
  讨论  32-34
第四部分:电泳技术分析家系样本rs220030位点多态性及等位基因亲源差异性甲基化状态  34-48
  材料和方法  34-40
    1 三联体样本的收集  34
    2 STR分型  34
    3 实验主要仪器和试剂  34-36
      3.1 主要仪器  34-35
      3.2 主要试剂  35-36
    4 实验方法  36-40
      4.1 三联体样本DNA抽提  36
      4.2 重亚硫酸盐修饰三联体DNA样品  36
      4.3 TaqMan SNP Genotyping Assay对三联体样本rs220030位点分型  36
      4.4 引物合成及PCR扩增  36-37
        4.4.1 MS-SSCA引物合成及扩增  36-37
        4.4.2 DGGE引物合成及扩增  37
      4.5 PCR扩增产物2.5%琼脂糖凝胶电泳  37
      4.6 变性梯度凝胶电泳(DGGE)  37-39
        4.6.1 TBE电泳缓冲液配制  37
        4.6.2 变性剂溶液配制  37-38
        4.6.3 10%梯度凝胶制备及电泳  38-39
      4.7 甲基化敏感性单链构象多态性分析(MS-SSCA)  39-40
        4.7.1 甲酰胺加样缓冲液配制  39
        4.7.2 0.5×TBE电泳缓冲液配制  39
        4.7.3 8%丙烯酰胺凝胶制备及电泳  39-40
  结果  40-46
    1 三联体样本STR分型结果  40-42
    2 三联体家系样本rs220030位点TaqMan分型结果  42-43
    3 PCR扩增产物2.5%琼脂糖凝胶电泳结果  43
    4 DGGE结果  43-44
    5 MS-SSCA结果  44-46
  讨论  46-48
全文小结  48-49
参考文献  49-53
综述  53-61
  参考文献  58-61
附录  61-62
致谢  62-63

印记基因SNRPN rs220030多态性及亲源差异性甲基化状态的研究

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