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低温胁迫香蕉叶片SSH文库的构建及其差异蛋白的初步研究

作　者: 祁君凤
导　师: 张银东
学　校: 海南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 低温胁迫 SSH差减文库蛋白组学指纹图谱
分类号: S668.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 85次
引　用: 2次
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内容摘要

香蕉(musa nana Lour.)是芭蕉科芭蕉属多年生大型常绿草本植物,分布于热带、亚热带100多个国家,但在大部分地区,香蕉常年都受到冬春寒流的侵袭,轻则香蕉叶、果受伤而减产,重则整株死亡。因此,研究香蕉产生寒害的机理,提高香蕉的抗寒力,在理论研究和生产实践中都具有重大的意义。为解析香蕉寒害的分子机制,分别运用抑制差减杂交技术(SSH)和蛋白双向电泳技术,通过生物信息学,对低温胁迫过程中的某些特异表达的基因、蛋白进行系统研究。应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractivehybridization, SSH)成功构建了低温胁迫下香蕉叶片与自然生长条件叶片差异表达的cDNA消减文库。经蓝、白斑筛选,共得到了142个阳性克隆。菌落PCR分析结果表明,95%左右的阳性克隆含有大小200～700 bp的插入片段。随机选取20个克隆进行了测序,并用基因检索工具(Genbank)对获得的EST进行了Blastx分析,结果表明,8个EST属于无任何序列线索的未知序列,4个属于未知功能的推测蛋白基因,2个属于未知功能的蛋白基因,3个与已知功能基因具有较高的同源性。应用半定量PCR技术,对编号28片段进行的表达分析结果表明,该片段为低温胁迫特异表达基因,在低温胁迫处理后10-24h范围内随处理时间的增加而表达量增强,自然条件下生长的香蕉叶片中没有检测到该基因的表达。应用蛋白质双向技术体系(包括香蕉叶片蛋白质提取方法的比较和优化、双向电泳条件的优化),开展了香蕉低温胁迫的比较蛋白质组学实验,对差异蛋白质进行了质谱鉴定和功能分析。分别用TCA／丙酮沉淀法、酚提取香蕉叶片总蛋白,并比较两种方法的提取效果,结果表明酚法是提取香蕉叶片总蛋白质最好的方法,提取的蛋白最完整。分析低温胁迫香蕉幼苗的叶片和正常生长香蕉幼苗的叶片蛋白质图谱,发现低温胁迫后特异表达蛋白质11个,2.5倍上调蛋白点4个,0.5倍下调蛋白13个。对28个差异蛋白质进行了质谱鉴定,2号为乙酰辅酶A羧化酶,3号和6号样品为核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶／加氧酶,还有8个与已知功能蛋白具有较高的同源性,7个属于未知功能的推测蛋白,5个属于未知功能的蛋白,另外5个样品在数据库中未检索到同源性和匹配率较高的蛋白质。这个结果表明,通过对构建的抑制性cDNA消减文库和筛选差异蛋白的全面分析,可能有相当多的未知功能基因参与了香蕉抗寒的过程。对其功能的深入了解将为全面解析香蕉寒害的分子机制、阐明寒害过程中的信号转导过程打下基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-32
  1.1 香蕉及香蕉产业  10
  1.2 香蕉寒害机理的相关研究  10-12
    1.2.1 叶片组织结构与细胞膜透性  10-11
    1.2.2 生物自由基学说  11
    1.2.3 冷调节蛋白及其诱导物质  11-12
  1.3 香蕉抗寒相关基因的克隆与表达  12
  1.4 差异表达基因分离技术及其应用  12-21
    1.4.1 mRNA差异显示  13-14
    1.4.2 cDNA代表性差异分析  14
    1.4.3 cDNA-AFLP  14-16
    1.4.4 抑制性消减杂交  16-21
      1.4.4.1 SSH主要技术流程  17-20
      1.4.4.2 SSH技术操作要点  20
      1.4.4.3 SSH技术评价  20-21
      1.4.4.4 SSH技术的应用  21
  1.5 蛋白质组学在植物病害中的研究应用  21-30
    1.5.1 蛋白质组学的概念及研究内容  22
    1.5.2 蛋白质组学研究的基本路线及相关技术  22-28
      1.5.2.1 蛋白质的提取技术  23
      1.5.2.2 蛋白质的分离技术  23-26
      1.5.2.3 蛋白质的检测技术  26
      1.5.2.4 蛋白质的图像分析技术  26
      1.5.2.5 蛋白质质谱鉴定技术  26-27
      1.5.2.6 蛋白质的生物信息学  27-28
    1.5.3 植物蛋白质组学  28-30
      1.5.3.1 作物遗传育种  28
      1.5.3.2 作物逆境胁迫应答  28-29
      1.5.3.3 作物品质改良和产量影响因子分析  29
      1.5.3.5 林木病害蛋白质组学分析  29-30
  1.6 技术路线  30-31
  1.7 本研究的目的和意义  31-32
2 材料与方法  32-50
  2.1 材料准备  32
    2.1.1 主要试剂  32
    2.1.2 材料  32
    2.1.3 生物信息学软件  32
  2.2 方法与步骤  32-50
    2.2.1 RNA提取  32-34
      2.2.1.1 准备工作  33
      2.2.1.2 改良的SDS法提取香蕉叶片RNA  33
      2.2.1.3 RNA电泳检测  33-34
      2.2.1.4 总RNA纯度、浓度检测  34
    2.2.2 mRNA的分离  34-35
    2.2.3 SSH文库的构建  35-42
      2.2.3.1 第一链cDNA的合成  35-36
      2.2.3.2 第二链cDNA的合成  36
      2.2.3.3 双链cDNA的RsaI酶切  36-37
      2.2.3.4 接头的连接  37-38
      2.2.3.5 接头连接效率检测  38-39
      2.2.3.6 第一次杂交  39-40
      2.2.3.7 第二次杂交  40
      2.2.3.8 两次PCR扩增  40-42
    2.2.4 差减文库构建及菌落PCR产物筛选  42-44
      2.2.4.1 PCR产物连接  42
      2.2.4.2 感受态细胞制备  42
      2.2.4.3 连接产物转化宿主菌E.coli DH5α感受态细胞  42-43
      2.2.4.4 菌落PCR鉴定重组子  43-44
    2.2.5 香蕉叶片总蛋白质提取  44-45
      2.2.5.1 三氯乙酸/丙酮沉淀法(TCA法)  44
      2.2.5.2 酚法提取香蕉叶片总蛋白  44-45
    2.2.6 蛋白质含量的测定(Bradford,1976)  45-46
      2.2.6.1 基本原理  45
      2.2.6.2 操作步骤  45-46
    2.2.7 蛋白质的单向电泳  46
    2.2.8 蛋白质的双向电泳  46-49
      2.2.8.1 第一向等电聚焦  46-48
      2.2.8.2 胶条平衡  48
      2.2.8.3 第二向SDS-PAGE电泳  48-49
    2.2.9 凝胶染色  49-50
    2.2.10 胶图象扫描与分析  50
3 结果与分析  50-61
  3.1 叶片总RNA提取与质量检测  50-51
  3.2 叶片cDNA的2次差减杂交和抑制性PCR  51-52
  3.3 抑制性差减cDNA文库的构建及PCR检测  52
  3.4 EST片段的测序和同源性分析  52-53
  3.5 No.28 EST的差异表达分析  53-54
  3.6 蛋白质的定量检测  54
  3.7 两种方法提取香蕉叶片蛋白的比较  54-56
    3.7.1 两种方法分别提取香蕉蛋白提取效率的比较  54-55
    3.7.2 两种方法分别提取香蕉叶片总蛋白SDS-PAGE电泳结果的比较  55-56
    3.7.3 不同上样量SDS-PAGE电泳结果的比较  56
  3.8 香蕉叶片总蛋白双向电泳分析  56-61
    3.8.1 香蕉低温胁迫差异蛋白质点在图谱中的位置  57-59
    3.8.2 香蕉低温胁迫差异蛋白质点的质谱鉴定与数据库查询  59-61
4 讨论  61-63
  4.1 香蕉低温胁迫cDNA消减文库的构建及初步分析  61-62
  4.2 香蕉低温胁迫差异蛋白的筛选及初步分析  62-63
    4.2.1 核酮糖-1,5一二磷酸羧化酶/加氧酶  62-63
    4.2.2 乙酰辅酶A羧化酶  63
5 结论  63-64
6 展望  64-65
参考文献  65-71
附录  71-78
致谢  78

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 多年生草本果类 > 香蕉
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