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人工诱导雌性花鳗鲡性腺发育成熟的研究

作　者: 齐鑫
导　师: 林浩然
学　校: 海南大学
专　业: 水产养殖学
关键词: 花鳗鲡 人工催熟 促性腺激素表达水平 类固醇激素 肝糖原 消化道
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


花鳗鲡是我国珍贵的食用鱼,经济价值高、营养丰富,资源十分匮乏,属国家二级野生保护动物。近年来,海南、广东等地积极发展花鳗鲡养殖业,但苗种短缺是制约养殖产业发展的主要因素之一。开展人工繁殖技术的研究对于花鳗鲡自然资源的保护和养殖产业的健康发展都有重要意义。但至今为止,花鳗鲡生殖内分泌和人工繁殖的研究未见有文献报道。本研究首次成功地利用外源激素诱导塘养花鳗鲡卵巢发育成熟,并研究了人工催熟过程中花鳗鲡卵巢发育的组织形态学特征；分析了卵巢发育不同时期,促性腺激素mRNA的表达以及血清中性类固醇激素浓度的变化规律。同时,对处于不同卵巢发育时期的肝脏及消化道的结构变化进行比较和分析,主要研究如下：1.采用多次肌肉注射LHRH-A2和CPE混合物的方法,诱导雌性花鳗鲡性腺发育成熟。其中,5尾肌肉注射生理盐水的对照组雌性花鳗鲡经20周后解剖观察,无1尾卵巢发育成熟,组织切片结果表明卵巢发育停留在Ⅰ-Ⅱ期,平均GSI为1.180%。15尾注射LHRH-A2和鲤鱼脑垂体匀浆(CPE)的实验组雌性花鳗鲡经20周后解剖观察,卵巢均有不同程度的发育,性腺系数明显升高,激素作用效果良好。2.用荧光实时定量PCR的方法检测了卵巢发育成熟过程中GtHα、LHB和FSHβ的mRNA表达量。结果表明：对照组GtHa、LHp和FSHβ的mRNA表达均较低(GtHa为0.65±0.44；FSHβ为0.0015±0.00056；LHβ为0.003±0.0014；n=5)；实验组鱼当性腺发育至卵黄生成期时,三个亚基的表达量(GtHa为4.14±0.42；FSHβ为0.53±0.18；LHβ为1.5±0.69；n=5)都明显高于对照组；当性腺发育到成熟阶段,三个亚基的表达量不同程度降低(GtHa为1.57±1.11；FSHβ为0.00089±0.00022；LHβ为0.088±-0.63；n=6),其中LHβ的含量只比卵黄生成期略有下降,仍然呈现高表达量,而FSHβ在卵巢发育成熟时的表达量明显下降,且比对照组低。3、利用放射性免疫测定技术(RIA)测定血清中类固醇激素的水平。结果显示,对照组雌性花鳗鲡血清中E2的含量较高(含量为48.79±29.75,ng／ml,n=5)；实验组鱼卵巢发育到卵黄生成期时,血清中E2含量较对照组为低(含量为9.81±6.94,ng/ml,n=5)；卵巢发育到成熟期时,血清中E2的含量较实验组为低(含量为4.14±2.12,ng/ml,n=5)；卵巢发育完全成熟时,血清中E2含量最低(含量为1.27±0.95,ng/ml,n=5)。结果表明,随着花鳗鲡卵巢的发育成熟,血清中E2的含量逐渐减少。对照组雌性花鳗鲡血清中T含量极低不在试剂盒灵敏度范围内,因此检测不到T的实际含量。实验组鱼卵巢发育到卵黄生成期时,血清中T含量为0.26±0.33,ng/ml(n=5)；卵巢发育到成熟期时,血清中T的含量较高(含量为0.38±0.29,ng/ml,n=5)；卵巢发育完全成熟时,血清中T含量达到最高(含量为1.43±0.41,ng/ml,n=5)。结果表明,随着花鳗鲡卵巢的发育成熟,血清中T的含量有增加的趋势。4.利用过碘酸雪夫反应(PAS),对肝糖原进行特异性染色。观察结果表明,对照组鱼肝糖原含量丰富,糖原骨架呈密集的网状结构,几乎看不到脂滴颗粒,平均肝脏系数为0.65%；实验组鱼性腺发育到Ⅱ期时,肝糖原含量减少,糖原骨架呈稀疏的网状结构,脂滴颗粒呈圆形或椭圆形,数量急剧增加,肝脏内几乎充满了脂滴颗粒,此时的平均肝脏系数为0.89%；性腺发育到Ⅲ-Ⅳ期时,肝糖原继续减少,糖原骨架所形成的网状结构几乎消失,脂滴颗粒开始减少,平均肝脏系数为1.07%；性腺发育到Ⅴ期时,肝糖原含量基本与Ⅲ-Ⅳ期时保持一致,而脂滴颗粒数量大量减少,平均肝脏系数为1.57%。结果表明随着卵巢的不断发育,肝脏系数随之增加。5.对照组平均消化道系数为1.242%,实验a组平均消化道系数和对照组几乎没有变化,为1.241%；实验b组平均消化道系数则极显著下降,为0.453%；实验c组平均消化道系数最低,仅为0.407%。花鳗鲡的胃和肠道则分为粘膜层、粘膜下层、肌肉层和浆膜层四层。对4组雌性花鳗鲡的消化道进行组织切片观察以及游标卡尺测量。结果表明,花鳗鲡的消化道各部分随着性腺系数的增加,呈现不同程度的退化。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第一章 文献综述  12-19
  1.1 花鳗鲡的研究概况  12-13
    1.1.1 花鳗鲡的地理分布  12
    1.1.2 花鳗鲡的形态特征  12
    1.1.3 花鳗鲡的生活习性  12
    1.1.4 花鳗鲡的繁殖规律  12-13
    1.1.5 花鳗鲡的资源现状及其开发利用  13
  1.2 鳗鲡人工繁殖的研究进展  13-14
    1.2.1 鳗鲡人工繁殖的背景  13-14
    1.2.2 人工诱导鳗鲡性腺发育与排卵的研究  14
  1.3 硬骨鱼卵巢发育的研究  14-16
    1.3.1 卵母细胞的发育  14
      1.3.1.1 卵母细胞的发育分期  14
      1.3.1.2 卵母细胞发育过程中的形态结构  14
    1.3.2 卵巢的发育  14-16
      1.3.2.1 卵巢的发育分期  14-16
  1.4 卵母细胞成熟的内分泌调控  16-17
    1.4.1 促性腺激素(GtH)  16
    1.4.2 成熟诱导激素(MIH)  16-17
    1.4.3 MIH受体  17
    1.4.4 成熟启动因子(MPF)  17
    1.4.5 生长因子  17
  1.5 卵母细胞的水合作用  17-19
第二章 实验部分  19-53
  第一节 激素诱导花鳗鲡卵巢发育成熟及其卵子发生的组织学研究  19-29
    1.1. 材料  19-20
      1.1.1 试验用鱼  19
      1.1.2 试验场所  19
      1.1.3 主要试剂和其它试验用品  19-20
      1.1.4 主要仪器设备  20
    1.2 方法  20-21
      1.2.1 实验设计  20
      1.2.2 鱼类生理盐水的配制方法  20
      1.2.3 性腺成熟系数(GSI)、肝脏系数和消化道系数的计算  20-21
      1.2.4 卵巢的石蜡切片及HE染色  21
    1.3 结果  21-23
      1.3.1 人工催熟的效果  21-22
      1.3.2 花鳗鲡卵子发生的组织学观察  22-23
      1.3.3 花鳗鲡成熟卵细胞的光学显微镜及扫描电镜观察  23
    1.4 讨论  23-25
    图版说明  25-26
    图版1  26-27
    图版2  27-28
    图版3  28-29
  第二节 卵巢发育不同时期花鳗鲡促性腺激素的MRNA水平的变化  29-36
    2.1 材料  29-30
      2.1.1 试验用鱼  29
      2.1.2 试验场所  29
      2.1.3 主要试剂和其他实验用品  29
      2.1.4 实验仪器  29-30
    2.2 方法  30-34
      2.2.1 实验设计  30
      2.2.2 总RNA的提取  30
      2.2.3 反转录  30-31
      2.2.4 PCR产物的分离、回收和纯化  31-32
      2.2.5 连接反应  32
      2.2.6 感受态的制备  32
      2.2.7 转化  32
      2.2.8 重组质粒的提取  32-33
      2.2.9 引物设计  33
      2.2.10 目的基因的定量  33-34
    2.3 结果  34
      2.3.1 卵巢发育不同时期脑垂体中GtHα、LHβ和FsHβ的mRNA水平变化  34
    2.4 讨论  34-36
  第三节 卵巢发育不同时期血清相关激素含量的变化  36-41
    3.1 材料  36
      3.1.1 试验动物  36
      3.1.2 试验场所  36
      3.1.3 主要试剂和其他实验用品  36
      3.1.4 试验仪器  36
    3.2 方法  36-38
      3.2.1 实验设计  36-37
      3.2.2 血样采集与处理  37
      3.2.3 雌性花鳗鲡卵巢发育过程中血清T和E_2含量的测定  37
      3.2.4 血清T含量的测定  37-38
      3.2.5 血清E_2含量的测定  38
      3.2.6 数据分析  38
    3.3 结果  38-40
      3.3.1 E_2的含量变化  38-39
      3.3.2 T的含量变化  39-40
    3.4 讨论  40-41
  第四节 卵巢发育不同时期肝细胞的糖原染色观察  41-46
    4.1 材料  41
      4.1.1 试验用鱼  41
      4.1.2 试验场所  41
      4.1.3 主要试剂和其他实验用品  41
      4.1.4 主要实验仪器  41
    4.2 方法  41-42
      4.2.1 实验设计  41-42
      4.2.2 肝脏的PAS染色  42
    4.3 结果  42-43
      4.3.1 卵巢发育不同时期肝脏糖原染色的观察  42-43
    4.4 讨论  43-44
      4.4.1 肝细胞显微结构的变化  43-44
    图版说明:  44-45
    图版4  45-46
  第五节 花鳗鲡卵巢发育到不同时期消化道结构的变化  46-52
    5.1 材料  46-47
      5.1.1 试验用鱼  46
      5.1.2 试验场所  46
      5.1.3 主要试剂和其它试验用品  46
      5.1.4 主要仪器设备  46-47
    5.2 方法  47-48
      5.2.1 实验设计  47
      5.2.2 消化道的石蜡切片及HE染色  47
      5.2.3 胃壁和肠壁厚度的测量  47-48
      5.2.4 数据处理  48
    5.3 结果  48-50
      5.3.1 卵巢发育不同时期消化道的变化  48-50
    5.4 讨论  50-52
  图版5  52-53
致谢  53-54
附录Ⅰ 缩略词表  54-55
附录Ⅱ 基因表达与血清激素检测的标准曲线  55-56
发表的论文和成果  56-57
参考文献  57-60

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
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