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高效液相色谱串联质谱法分析工频磁场暴露对细胞内神经酰胺的影响

作　者: 徐娜妮
导　师: 孙文均
学　校: 浙江大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 工频磁场神经酰胺高效液相色谱串联质谱母离子扫描模式多重反应监测模式酸性鞘磷脂酶
分类号: R144
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

工频磁场(Power frequency magnetic fields)是指极低频磁场(extremely low frequency electromagnetic fields, ELF MF)中频率为50或60 Hz的一种交变磁场,主要来源于配电所,高、低压输电线路,以及各种用电设备的使用。虽然不乏阴性结果存在,然而许多流行病学调查研究结果显示,极低频磁场的日常生活暴露或职业暴露会增加儿童白血病、脑瘤和乳腺癌等肿瘤的发病率；动物研究结果显示,工频磁场暴露可影响多种动物的激素水平、神经细胞损伤、生育能力以及行为方式等。此外,细胞水平的研究结果显示工频磁场辐照可诱导细胞产生多种生物学效应如增殖、DNA损伤等。另有研究表明,极低频电磁场除了可以产生不良的生物效应外,也能产生一些有益的非热效应,即正效应,如极低频电磁场可用于防止骨质钙流失,治疗炎性疾病,如腱炎,骨关节炎等。然而,工频磁场产生生物效应及其相关机制至今尚未阐明。因此,探索外界工频磁场究竟通过何种机制将自身的物理信号传递给生物体,并产生相应的生物学效应,已成为该研究领域急需解决的难题。有研究发现,外界刺激因子如CD95、CD40、Fas配体以及紫外线、γ射线等作用于细胞后,可诱导酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase, A-SMase)活化、易位至细胞膜上的脂筏结构,继而水解脂筏中的鞘磷脂产生神经酰胺(ceramide, CER),神经酰胺通过氢键作用而彼此交联并诱导脂筏结构融合汇集,从而使脂筏上相应受体发生聚簇,最终导致初始信号的扩大,产生后续的生物学效应。本实验室早期研究发现,0.4mT的工频磁场能够诱导细胞膜表皮生长因子受体(EGFR)聚簇。当细胞膜上的脂筏结构遭到破坏时,0.4 mT,50 Hz工频磁场所诱导的细胞膜表面EGFR聚簇现象被抑制。该结果证实工频磁场诱导的细胞膜EGFR聚簇与脂筏结构密切相关。同时,研究还发现0.4 mT,50 Hz工频磁场可以诱导A-SMase的易位并与胞膜中的脂筏发生共定位；利用丙咪嗪(imipramine)抑制A-SMase活性可阻断工频磁场诱导的EGFR聚簇,在此条件上加入C2-CER,发现EGFR聚簇重新形成。上述研究表明A-SMase参与该通路的信号转导,提示神经酰胺可能在该通路中发挥了作用。神经酰胺是一类由偶数链脂肪酸(2-28个碳)和鞘氨醇基团连接而成的鞘脂类物质代谢产物,是细胞内重要的第二信使,其中长链神经酰胺如C16-C24被认为与诱导凋亡的配体、DNA损伤以及热休克等细胞应激相关。为了进一步明确工频磁场对细胞神经酰胺代谢的影响,本研究选用高效液相色谱串联四级杆质谱法(high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS)分析工频磁场暴露条件下细胞内神经酰胺的种类及含量变化。实验方法评测利用C16-CER、C17-CER、C18-CER、C24-CER标准品优化实验参数,在多重反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)模式下对HPLC-MS/MS定量神经酰胺的能力进行评测。结果显示,在本实验条件下,理论上C16-CER、C17-CER、C18-CER、C24-CER四种神经酰胺的检出限分别为3.50,2.18,9.32,1.02μg/ml;检测限分别为11.67,7.26,31.06,3.40μg/ml;各标准曲线线性良好,相关系数均在0.99以上。将1μg细胞内不存在的C17-CER标准品加入细胞样品中进行脂类提取,最终样本溶液定容为1ml,检测其C17-CER浓度,并与1μg/ml标准溶液比较,得到C17-CER回收率为(86.67±5.64)%。全扫描分析工频磁场暴露前后细胞内神经酰胺种类选择前体离子扫描模式(precursor ion scanning, PIS),通过扫描神经酰胺特征碎片(鞘氨醇基团,m/z 264)的前体离子,即可获得含有该种鞘氨醇基团的所有脂类物质(包括神经酰胺及其它含有m/z 264碎片的脂类物质)的谱图,通过脂类数据库Lipid Maps Structure Database (LMSD)的查找比对,初步分析工频磁场暴露和非暴露条件下,细胞样品中可能含有的神经酰胺。结果发现细胞脂类提取样品中含有疑似C16、C18和C24-CER,但由于可能存在质量数重叠的分子干扰问题,尚需进一步与相应标准品做滞留时间上的比对,进行鉴定。C16、C18、C24-CER鉴定为了进一步鉴定上述全扫描获得的结果,选择MRM模式并对细胞脂类提取样品中的疑似神经酰胺和对应神经酰胺标准品经脂类提取步骤后的滞留时间进行比对,设置时间窗为5%。结果显示,细胞脂类提取样品中只有RT为9.31的疑似C24-CER色谱峰在C24-CER标准品提取物的时间窗内,而细胞样品中疑似C16-CER和C18-CER色谱峰均在其对应神经酰胺标准品提取物对应时间窗外,因此实验结果认为FL细胞脂类提取样品中存在C24-CER,尚未检测到其它神经酰胺。此外,我们发现标准品经脂类提取后,其滞留时间相对于原神经酰胺标准溶液有所减少,配对T检验p<0.01,差异具有显著性,由此我们认为细胞的脂类提取过程对神经酰胺的滞留时间会造成一定的影响,这也可能是细胞内神经酰胺和标准品神经酰胺滞留时间不一致的原因之一。检测工频磁场暴露对细胞内神经酰胺含量影响以细胞内不存在的C17-CER作为内标,选择多重反应监测模式(MRM)同时扫描前体离子和子离子,对待测神经酰胺进行定量分析,比较不同工频磁场暴露时间对细胞内神经酰胺含量的影响。结果显示,与阴性对照组相比,50Hz,0.4mT工频磁场持续暴露5min.15min、30min后C24-CER含量均升高,差异具有显著意义(p<0.05)；且由阴性组、5min组、15min组观察到C24-CER含量随着暴露时间的增加而逐渐升高,差异具有显著意义(p<0.05);30mmin组的C24-CER含量与15min组比有下降趋势,差异无显著意义(p>0.05),但仍高于阴性对照组和5min暴露组,差异具有显著意义(p<0.05)。结论：在本研究条件下,基于所获得的实验结果,可得出如下结论：1.本次实验结果显示人羊膜FL细胞样品中存在C24-CER,未检测到其他种类神经酰胺,C24-CER本底水平约为1.62μg/mg蛋白。2.50Hz,0.4mT工频磁场短时间暴露可引起FL细胞内神经酰胺含量增加。

全文目录

致谢  4-6
中文摘要  6-10
Abstract  10-15
缩略语  15-16
目次  16-17
1. 引言  17-22
2 实验材料  22-25
  2.1 主要仪器设备  22
  2.2 主要耗材  22-23
  2.3 主要试剂  23
  2.4 工频磁场辐照系统  23-24
  2.5 分析软件  24-25
3 实验方法  25-30
  3.1 实验方法评测  25-27
  3.2 全扫描工频磁场暴露前后细胞内神经酰胺种类  27-28
  3.3 疑似神经酰胺鉴定  28
  3.4 检测工频磁场暴露对细胞内神经酰胺含量影响  28-30
4 实验结果  30-37
  4.1 实验方法评测  30-31
  4.2 全扫描工频磁场暴露前后细胞内神经酰胺种类  31-33
  4.3 疑似神经酰胺鉴定  33-35
  4.4 检测工频磁场暴露对细胞内C24-CER含量影响  35-37
5 讨论  37-41
6 结论  41-42
参考文献  42-47
综述  47-59
  参考文献  54-59
作者简介及科研成果  59

高效液相色谱串联质谱法分析工频磁场暴露对细胞内神经酰胺的影响

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