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苹果酸脱氢酶包涵体的表达及复性研究

作　者: 付敏玲
导　师: 董晓燕
学　校: 天津大学
专　业: 生物化工
关键词: 大肠杆菌苹果酸脱氢酶表达包涵体人工伴侣复性
分类号: TQ920.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 295次
引　用: 3次
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内容摘要

苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase,EC 1.1.1.37,MDH)是一种重要的糖代谢酶,在生物体内特异性催化L-苹果酸成为草酰乙酸从而完成三羧酸循环。可利用MDH底物专一性特征,将其用于拆分DL-苹果酸以得到重要的手性碳源D-苹果酸。此外,MDH具有同源二聚体分子结构,这一结构的特殊性决定了MDH常被用作于寡聚蛋白分子的结构及功能研究的模型分子。鉴于MDH重要的经济及科研价值,本文以大肠杆菌苹果酸脱氢酶(E.coli MDH,eMDH)为研究对象,进行了eMDH的克隆、表达及复性研究。首先运用PCR方法从大肠杆菌基因组DNA中扩增出编码eMDH的cDNA,将其与温控质粒载体pBV220连接构建重组质粒;经限制性内切酶酶切分析及全序列分析得到阳性重组子。继而进行基因工程菌培养,42℃诱导外源蛋白eMDH的表达。SDS-PAGE分析发现外源蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在于破菌沉淀中;经电泳凝胶光密度扫描分析得目标蛋白表达量占全菌蛋白的42%;包涵体蛋白的产量为87.3mg?(L培养液)-1。对包涵体蛋白进行脲及Triton洗涤纯化后,蛋白纯度由表达后的42%增加到72%。在包涵体复性得研究中,重点考察了人工伴侣体系对eMDH包涵体的促进复性作用。结果显示,当酶浓度为0.1mg?mL-1,CTAB与β-环糊精的浓度比为0.6mmol?L-1:4.8 mmol?L-1 (1:8),pH值为7.6,变性剂脲终浓度为0.32 mol?L-1及5mmol?L-1 DTT存在时,人工伴侣可有效辅助eMDH复性,复性后的比活可达160U/mg。利用荧光光谱法、圆二色光谱法分析表明,复性后的eMDH具有正确的分子结构。体积排阻色谱分析证明,其比自发复性的eMDH含有更多的二聚体分子。另外,温度动力学结果显示,低温有利于降低eMDH分子的折叠反应速率,提高eMDH的复性比活;与自发复性相比,人工伴侣辅助复性体系,可以降低eMDH的折叠速率,有效协助eMDH折叠为正确的结构。

全文目录

中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-9
前言  9-10
第一章文献综述  10-28
  1.1 苹果酸脱氢酶的简介  10-16
    1.1.1 苹果酸脱氢酶的理化性质及生理功能  10-11
    1.1.2 苹果酸脱氢酶的用途  11
    1.1.3 苹果酸脱氢酶的结构分析  11-14
    1.1.4 苹果酸脱氢酶活性检测  14-15
    1.1.5 苹果酸脱氢酶的表达研究  15-16
  1.2 基因工程重组蛋白质在大肠杆菌中的表达  16-20
    1.2.1 目标基因获得——PCR 技术  16-18
    1.2.2 表达载体选择  18
    1.2.3 表达产物的定位  18-20
  1.3 包涵体蛋白质复性  20-26
    1.3.1 蛋白质体外复性  20-23
    1.3.2 复性动力学模型  23-24
    1.3.3 苹果酸脱氢酶复性的研究现状  24-26
  1.4 本文的研究意义及主要内容  26-28
第二章苹果酸脱氢酶的表达  28-47
  2.1 实验材料  28-30
    2.1.1 菌种和载体  28
    2.1.2 工具酶及分子量参照物  28-29
    2.1.3 主要化学试剂  29
    2.1.4 主要仪器  29-30
    2.1.5 引物合成  30
  2.2 实验方法  30-38
    2.2.1 PCR 扩增目的基因  30-33
    2.2.2 pBV220-eMDH 表达质粒的构建  33-34
    2.2.3 pBV220-eMDH 的转化及阳性克隆的筛选  34-36
    2.2.4 目标蛋白质在大肠杆菌中的诱导表达  36-37
    2.2.5 SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳检测表达产物  37-38
    2.2.6 蛋白质含量的测定  38
  2.3 结果与讨论  38-45
    2.3.1 PCR 产物的酶切鉴定  38-39
    2.3.2 阳性克隆的鉴定  39-41
    2.3.3 目标基因的序列测定  41-44
    2.3.4 基因工程菌生长曲线的测定  44
    2.3.5 表达产物的鉴定  44-45
    2.3.6 表达产物蛋白质含量的测定  45
  2.4 本章小结  45-47
第三章苹果酸脱氢酶包涵体的纯化、变性及复性  47-73
  3.1 实验材料和设备  47-48
  3.2 实验方法  48-50
    3.2.1 包涵体纯化  48-49
    3.2.2 包涵体的溶解和变性  49
    3.2.3 包涵体的复性  49-50
    3.2.4 荧光光谱分析  50
    3.2.5 圆二色光谱分析  50
    3.2.6 体积排阻色谱分析  50
    3.2.7 苹果酸脱氢酶活性测定  50
  3.3 结果及讨论  50-71
    3.3.1 包涵体纯化结果  50-51
    3.3.2 包涵体变性时间对复性效果的影响  51-52
    3.3.3 苹果酸脱氢酶包涵体复性初探  52-57
    3.3.4 人工伴侣辅助苹果酸脱氢酶包涵体复性条件探索  57-64
    3.3.5 人工伴侣辅助复性的复性产物结构分析  64-69
    3.3.6 人工伴侣辅助复性的温度动力学分析  69-71
  3.4 本章小结  71-73
第四章结论与展望  73-75
  4.1 结论  73-74
  4.2 展望  74-75
附录  75-77
参考文献  77-83
发表论文情况  83-84
致谢  84

苹果酸脱氢酶包涵体的表达及复性研究

内容摘要

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