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用酵母双杂交系统筛选与PEN-2相互作用蛋白的初步研究

作　者: 程鹏
导　师: 刘润忠；许华曦
学　校: 厦门大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 酵母双杂交 PEN-2 阿尔茨海默氏症
分类号: Q51-33
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 105次
引　用: 1次
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内容摘要

PEN-2蛋白(Presenilin enhancer protein 2)是一种与阿尔茨海默氏症(Alzheimer’s Disease,AD)密切相关的蛋白。PEN-2在γ-分泌酶的组装和成熟中扮演重要的角色,它对于AD途径和Notch信号转导途径起着调节作用。另外,也有报道PEN-2还具有促进神经细胞存活和防止其不被凋亡的作用。但是,这些研究结果还不足以充分阐明它在生理活动中的功能及其作用机制。我们采用酵母双杂交法筛选与它有相互作用的蛋白,以便更好地认识和理解PEN-2在阿尔茨海默氏症病理过程中的机制。以PEN-2为诱饵蛋白筛选人胎脑文库后,我们得到25个阳性克隆。阳性克隆测序并将测序结果用BLAST分析,3,44,47,54号阳性克隆的氨基酸序列分别和人PCBP4 [poly(rC) binding protein 4]、TXNDC9 (thioredoxin domain containing 9)、FTL (ferritin, light polypeptide)和GRK5 (G protein-coupled receptor kinase 5) 4种蛋白具有高度的同源性。β-半乳糖苷酶活性测定说明这4种蛋白在酵母AH109中可以与PEN-2发生相互作用。在进一步的实验中,我们成功地构建了哺乳动物表达载体pCMV5-HA-PEN2,pCMV-myc-TXNDC9和pCMV-myc-FTL。其中TXNDC9和FTL融合蛋白在293T细胞中有效表达。通过以上实验,我们认为筛选出的4个蛋白在酵母中和PEN-2之间存在相互作用;其中推测PCBP4可能参与了PEN-2在促进神经细胞存活方面的功能;而FTL在维持细胞内铁的稳定性和中枢神经系统内铁的代谢平衡,防止在早老性痴呆中的脑内局部铁的异常积累有重要作用。我们还成功地构建了两种筛选出的蛋白的哺乳动物表达载体,为在哺乳动物细胞内验证它们和PEN-2是否存在相互作用奠定了基础。这些发现有助于进一步了解PEN-2的功能,同时也为阿尔茨海默氏症的治疗提供了新的思路。本文的创新之处:应用酵母双杂交系统首次从真核细胞体内筛选到4种和PEN-2相互作用的蛋白,并证明它们可以在酵母AH109中与PEN-2发生相互作用,为进一步研究PEN-2的功能及在AD中的病理机制打下一个坚实的基础。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章绪论  8-24
  1.1 阿尔茨海默氏症  8-11
  1.2 PEN-2 的研究进展  11-16
  1.3 酵母双杂交系统的基本原理及应用  16-21
  1.4 本课题的主要目的和技术路线  21-24
第二章诱饵质粒pGBKT7-PEN2 的构建与鉴定  24-38
  2.1 实验材料  24-29
  2.2 实验方法  29-31
  2.3 结果  31-36
  2.4 讨论  36-38
第三章人胎脑文库的筛选  38-53
  3.1 实验材料  38-40
  3.2 实验方法  40-45
  3.3 实验结果  45-48
  3.4 讨论  48-53
第四章哺乳动物表达载体的构建和检测  53-61
  4.1 实验材料  53-54
  4.2 实验方法  54-57
  4.3 结果  57-60
  4.4 讨论  60-61
结论与展望  61-62
参考文献  62-67
附录  67-71
致谢  71

用酵母双杂交系统筛选与PEN-2相互作用蛋白的初步研究

内容摘要

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