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成骨相关转录因子Osterix启动子调控机制初步研究

作　者: 李益广
导　师: 洪岸；孙奋勇
学　校: 暨南大学
专　业: 遗传学
关键词: Osterix 启动子 调控
分类号: Q343
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 98次
引　用: 4次
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内容摘要


目的 在Osterix基因5’端上游区域搜寻BMP-2诱导Osterix转录上调的转录因子潜在核心作用区域，作为后续深入研究的基础。 方法 用Real-Time Q-PCR的方法检测出在转录水平上BMP-2能诱导Osterix的表达上调，然后用PCR的方法，从BAC-RP23-118K10克隆中，扩增出一系列不同长度的Osterix启动子片断，将上述片断克隆到Luciferase报告载体pGL3-Basic Vector中，构建出一系列Osterix启动子缺失突变的报告载体。将构建好的载体和内参pRL-TK共转染至C2C12、C3H10T1／2、和MC3T3三种细胞中，BMP-2诱导48小时后用Dual-Luciferase Reporter Assay System检测不同样品中Luciferase的表达量。通过其表达量的变化，分析其启动子上的调控区域。 结果 BMP-2在转录水平存在对Osterix的调控作用，成功的构建了一系列Osterix启动子缺失突变的报告载体，通过检测，找到了对Osterix基础表达活性有上调作用的三个潜在控制区，即-100～+81、-760～-560和-1254～-1042及两个潜在的BMP-2调控Osterix表达下调的控制区-100～+81和-760～-560。 结论 初步确定了Osterix核心启动子区域，并建立了一个对Osterix转录水平调控的研究平台。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-9
一.前言  9-26
  1.文献综述:  9-23
    1.1 骨的发生  9-10
    1.2 成骨细胞分化过程中主要转录因子的研究及进展  10-16
    1.3 Osterix调控机制的研究和进展  16-18
    1.4 Real-Time Quantitative PCR概述  18-21
    1.5 双荧光素酶报告基因测试系统(DLR)概述  21-23
  2.本论文的研究内容及意义  23-25
    2.1 研究内容  23-24
    2.2 研究意义  24-25
  3.研究思路  25-26
    3.1 Real-Time Q-PCR检测Osterix基因是否在RNA水平上受到调控  25
    3.2 BMP-2相关的Osterix启动子核心区域探寻  25-26
二.实验仪器与材料  26-31
  1.主要仪器  26-27
  2.材料  27-31
    2.1 细胞株及质粒  27
    2.2 工具酶和试剂盒  27-28
    2.3 常用试剂及配方  28-31
三.实验方法  31-47
  1.BMP-2诱导C2C12,C3H10T1/2和MC3T3-E1,并检测Osterix的表达  31-36
    1.1 细胞的BMP-2诱导  31
    1.2 细胞总RNA的抽提  31-32
    1.3 用DNase Ⅰ(RNase free)处理RNA  32
    1.4 总RNA纯度和完整性检测  32-33
    1.5 逆转录  33
    1.6 常规PCR检测逆转录是否成功  33-34
    1.7 Real-Time Q-PCR检测Osterix表达水平  34-36
  2、Osterix启动子缺失突变的Luciferase报告载体构建  36-44
    2.1 实验设计  36-38
    2.2 BAC的制备  38
    2.3 PCR扩增  38-40
    2.4 切胶回收纯化PCR或酶切产物  40-41
    2.5 酶切反应  41
    2.6 连接反应  41-42
    2.7 点击转化宿主大肠杆菌  42
    2.8 重组子的快速鉴定  42-43
    2.9 质粒抽提  43
    2.10 双酶切鉴定  43-44
  3.BMP-2相关的Osterix核心启动元件的探寻  44-47
    3.1 实验设计  44
    3.2 转染用质粒制备  44-45
    3.3 质粒转染C2C12,C3H10T1/2和MC3T3-E1细胞  45
    3.4 BMP-2诱导转染后的细胞  45
    3.5 Dual-Luciferase Reporter Assay System检测Luciferase活性  45-47
四.结果与分析  47-58
  1.BMP-2分别诱导C2C12,C3H10T1/2和MC3T3-E1,并检测Osterix的表达  47-50
    1.1 细胞总RNA的纯度和完整性检测  47
    1.2 常规PCR检测逆转录  47-48
    1.3 Real-Time Q-PCR检测不同样本的Osterix表达水平  48-49
    1.4 小结  49-50
  2.Osterix启动子区域生物信息学分析  50-52
    2.1 不同种属Osterix启动子区域高度保守区探寻  50
    2.2 Osterix启动子区域转录因子结合位点预测  50-52
  3.Osterix启动子缺失突变的Luciferase报告载体构建  52-54
    3.1 PCR扩增  52-53
    3.2 载体鉴定  53-54
  4.BMP-2相关的Osterix核心启动元件的探寻  54-57
  小结  57-58
五.讨论  58-62
  1.细胞株的选择策略  58
  2.启动子区域的预测  58-60
  3.启动子核心区域探寻及结果分析  60-62
六.总结与展望  62-64
  1.总结  62
  2.展望  62-64
七.参考文献  64-67
八.附录  67-69
  1.pGL3-NBOP1.3K克隆测序结果图谱  67-68
  2.pGL3-NBOP1.3K全序列  68-69
九.致谢  69

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中图分类: > 生物科学 > 遗传学 > 遗传学分支学科 > 细胞遗传学
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