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猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5蛋白跨膜区删除对小鼠免疫效果的影响

作　者: 陈勇军
导　师: 陈溥言
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪繁殖与呼吸综合症病毒 orf5基因跨膜区 A、B表位免疫效果
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 232次
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内容摘要

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)ORF5基因的核苷酸序列设计3对特异性引物，从重组质粒pMD-ORF5中扩增去除ORF5基因中包括全部信号肽在内的N端跨膜区(28 residues)和A表位基因，保留B表位基因。另外将该跨膜区和ORF5基因中部跨膜区(60 residues)同时删除。改造后的ORF5基因分别命名为ORF5-1和ORF5-2。将2个基因片段定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)，构建重组质粒pET-ORF5-1和pET-ORF5-2，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导表达和SDS-PAGE电泳分析，ORF5-1和ORF5-2基因获得融合表达，表达量分别为12.2％和39％。结果证明删除双跨膜区能明显提高ORF5基因的表达量。经western-blot分析，融合蛋白具有一定的免疫学活性。表明摘除跨膜区对该蛋白的抗原性影响不大。比较猪繁殖与呼吸综合症病毒ORF5基因的原核表达质粒pET-ORF5-1和pET-ORF5-2在体外表达效率以及体内的免疫效果，以期从中选出高效的猪繁殖与呼吸综合症病毒亚单位疫苗。应用His-bind树脂层析柱纯化重组GP5蛋白，将表达产物6P5-1和GP5-2纯化、复性并免疫6～8周龄小鼠，用间接ELISA法、微量血清中和法与MTT法检测小鼠血清中特异性抗重组蛋白抗体、血清中和抗体水平以及脾脏中淋巴细胞增殖功能。结果表明GP5-1和GP5-2蛋白刺激机体产生了较高水平的抗体滴度为1∶1600，但是经微量中和试验发现中和抗体均小于1∶4。不过两者均能诱导小鼠产生特异性淋巴细胞增殖反应，淋巴细胞增殖水平无显著差异，与对照组相比差异显著(P＜0.05)。本研究探讨了提高PRRSV orf5 gene表达效率的方法，并证实删除跨膜区的GP5蛋白能很好的诱导小鼠体液免疫和细胞免疫，对今后深入研究PRRSV蛋白的结构和生物学功能以及研制针对PRRSV新型基因工程疫苗奠定了基础。

全文目录

原创性声明  3
学位论文版权使用授权书  3-5
中文摘要  5-6
英文摘要  6-7
第一章猪繁殖与呼吸综合症病毒分子生物学研究进展  7-21
  1.病毒的生物学特性  7-8
  2.病毒的基因组结构  8-9
  3.病毒基因组的转录及表达  9
  4.病毒基因组所编码的蛋白  9-11
  5.病毒结构蛋白的抗原性  11
  6 PRRSV的免疫  11-14
  7 结语  14-15
  参考文献  15-21
第二章猪繁殖与呼吸综合症病毒基因工程疫苗研究进展  21-25
  1 大肠杆菌表达系统  21
  2 杆状病毒和酵母表达系统  21-22
  3 冠状病毒表达系统  22
  4 核酸疫苗  22-23
  5 结语  23
  参考文献  23-25
第三章猪繁殖与呼吸综合症病毒ORF5基因跨膜区序列的删除及其原核表达  25-38
  摘要  25-26
  1 材料与方法  26-33
  2 结果  33-34
  3 讨论  34-36
  英文摘要  36
  参考文献  36-38
第四章猪繁殖与呼吸综合症病毒GP5蛋白跨膜区删除对免疫效果的影响  38-49
  摘要  38
  1 材料与方法  38-41
  2 结果  41-44
  3 讨论  44-46
  英文摘要  46
  参考文献  46-49
附录  49-50
全文总结  50-51
致谢  51

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5蛋白跨膜区删除对小鼠免疫效果的影响

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