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猪流感病毒表位抗原基因串联表达及小鼠免疫试验

作　者: 师小潇
导　师: 马勋；刘惠莉
学　校: 石河子大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪流感病毒表位抗原小鼠免疫试验
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

猪流感(Swine influenza, SI)是由A型流感病毒引起的一种猪的急性呼吸道传染病,一年四季均可发生,各种日龄的猪都可感染。目前对猪流感尚无有效的治疗手段,临床上主要通过疫苗接种预防该病。SI的商品化灭活疫苗主要是H1NI型和H3N2亚型单价或双价全病毒灭活疫苗。但由于近年来重组毒株频繁出现,以传统流行株为毒种的灭活疫苗已无法提供理想的保护作用,因此人们开始对SIV进行新型疫苗研究,以应对其高度变异的特性。本研究选择SIV主要结构蛋白的T、B细胞抗原表位片段,将多个表位片段串联,定向克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,命名为pET-30a-EP1。经测序鉴定阅读框正确后,转化宿主菌BL21(DE3),以IPTG诱导,目的片段获得成功表达。SDS-PAGE电泳,表达重组蛋白为27KD,与预期大小相相符。免疫转印试验显示,重组蛋白可以与His-tag抗体发生免疫学反应,表明表达重组蛋白为构建的目的蛋白,命名EP1。经BCA蛋白定量试剂盒分析,蛋白浓度为1306.88μg/mL。本室采用不同的表位抗原基因串联表达,获得了第二种表位抗原蛋白,命名EP2。纯化的EP1蛋白、EP2蛋白分别采用皮下和滴鼻方式免疫6周龄KM小鼠。间接ELISA检测小鼠血清IgG抗体、鼻液IgA抗体水平。结果,EP1蛋白免疫小鼠的血清IgG、局部粘膜IgA抗体水平均高于PBS对照组,EP2蛋白皮下免疫组血清IgG、滴鼻免疫组局部粘膜IgA抗体水平高于PBS对照组,但滴鼻免疫组血清IgG抗体较低。MTT法分析小鼠脾脏T淋巴细胞增殖反应。结果,EP1、EP2蛋白免疫组T淋巴细胞对免疫原刺激反应明显高于PBS组。HI试验检测SIV血凝抗体,皮下注射组抗SIV H1N1亚型病毒效价均达1：128以上,EP1滴鼻组的HI效价1：64；但EP2蛋白滴鼻免的HI效价只有1：4。结果表明,所构建的融合蛋白获得很好的表达,EP1重组蛋白无论以何种途径免疫小鼠,均可诱导小鼠产生较好的体液免疫反应和细胞免疫反应,其中滴鼻免疫还获得了理想的局部免疫分泌型IgA抗体,为阻止病毒由黏膜途径感染提供了有力的保护屏障。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-10
英文缩略词表  10-11
前言  11-12
第一章文献综述  12-26
  1 猪流感病毒特性  12
  2 猪流感病毒编码蛋白及其功能  12-16
    2.1 HA蛋白  13-14
    2.2 NA蛋白  14-15
    2.3 NP蛋白  15
    2.4 聚合酶蛋白  15-16
    2.5 基质蛋白(M)  16
    2.6 非结构蛋白  16
  3 猪流感流行病学  16-19
  4 猪流感病毒的种间传播  19-20
  5 猪流感病毒的诊断  20
  6 猪流感病毒疫苗研制  20-26
    6.1 猪流感灭活疫苗  20-21
    6.2 重组猪流感病毒活载体疫苗研究  21-22
    6.3 表位疫苗及其研究  22-26
第二章试验部分  26-48
  试验一猪流感HA基因表位抗原串联表达  26-38
    1 材料  26-27
      1.1 菌株与质粒  26
      1.2 主要试剂  26
      1.3 主要仪器  26-27
    2 方法  27-32
      2.1 重组表达质粒pET-30a-EP1的构建  27-28
      2.2 表达载体pET-03a-PEI质粒提取及转化BL12(DE3)  28-29
      2.3 重组质粒在大肠杆菌BL21中的诱导表达  29
      2.4 SDS-PAGE检测重组蛋白的表达  29
      2.5 Western blot检测重组蛋白的表达  29-30
      2.6 重组蛋白的纯化  30-31
      2.7 纯化蛋白的检测及定量  31-32
    3 结果  32-35
      3.1 重组表达质粒pET-30a-Ep1的构建  32
      3.2 重组质粒在大肠杆菌BL21中的诱导表达  32-33
      3.3 Western blot  33-34
      3.4 重组蛋白纯化后的蛋白电泳  34
      3.5 BCA蛋白定量结果  34-35
    4 讨论  35-38
  试验二重组表达蛋白小鼠免疫活性研究  38-48
    1 材料  38-39
      1.1 主要仪器  38
      1.2 实验动物  38
      1.3 主要试剂  38
      1.4 试剂配制  38-39
    2 方法  39-42
      2.1 试验动物分组及动物免疫  39-40
      2.2 间接ELISA的操作程序  40
      2.3 1%的红细胞制备方法  40-41
      2.4 SIV病毒的灭活  41
      2.5 MTT增殖试验  41-42
      2.6 统计学分析  42
    3 结果  42-46
      3.1 皮下免疫小鼠血清IgG抗体水平的检测  42
      3.2 滴鼻免疫小鼠血清IgG抗体水平的检测  42-43
      3.3 滴鼻免疫小鼠粘膜IgA抗体水平的检测  43-44
      3.4 抗猪流感病毒特异性HI抗体检测  44
      3.5 T淋巴细胞增殖试验  44-46
    4 讨论  46-48
结论  48-49
创新点  49-50
参考文献  50-56
附录:常用试剂的配制  56-60
致谢  60-61
课题来源:上海市科委农医重点项目  61-62
作者简介  62-63
石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表  63

猪流感病毒表位抗原基因串联表达及小鼠免疫试验

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