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鸭肠炎病毒gC和gE优势抗原表位的筛选

作　者: 崔立虹
导　师: 王君伟
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸭肠炎病毒糖蛋白C 糖蛋白E 优势抗原表位筛选
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis,DVE),又名鸭瘟(Duck plague,DP),是由鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)引起的鸭、鹅及多种雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病,具有流行广泛,传播迅速,发病率和死亡率高等特征。该病在世界范围内的发生和流行给水禽养殖业带来了巨大的经济损失。gC和gE是鸭肠炎病毒的两种主要囊膜蛋白,其中gC具有良好的免疫原性和抗原性以及刺激机体T细胞增殖的功能,gE含有中和抗原表位,蛋白胞外区和胞内区均具有良好的抗原性,并且可以参与病毒吸附和病毒在细胞与细胞间直接传播的过程。本研究利用大肠杆菌pET-32a表达系统,实现了截短蛋白的融合表达,结合蛋白质印迹技术,筛选出DEV gC和gE的优势抗原表位,从而对DEV的主要抗原结构有了进一步的认识,为亚单位疫苗及诊断试剂的研制提供基本的物质基础。为了分析鸭肠炎病毒gC和gE的优势抗原表位区,分别设计了7个覆盖gC胞外区和7个覆盖gE胞外区和胞内区的多肽片段,进行融合表达,经Western blot分析表明gC-1(27-96aa),gC-2(74-149aa),gE-5(241-325aa),gE-7(433-490aa)能够被DEV阳性血清所识别。为了进一步鉴定鸭肠炎病毒gC和gE的优势抗原表位区,进行了第二轮的抗原表位筛选,结果显示gC-2.1(67-104aa),gE-5.3(290-325aa),gE-7.3(449-475aa),gE-7.4(463-490aa)具有良好的抗原性。在此基础上,又进行了第三轮的抗原表位筛选,分别设计了5个覆盖gC-2.1、5个覆盖gE-5.3和6个覆盖gE-7.3和gE-7.4的多肽片段,每个多肽片段合成一对寡聚核酸片段,经磷酸化退火后插入表达载体pET-32a进行融合表达及纯化,经Western blot鉴定具有抗原性的片段为:gC-2.1-B(73-88aa)、gC-2.1-C(79-94aa)、gE-5.3-B,gE-5.3-C(296-315aa)和gE-7.3-B~7.4-B(455-485aa)。最后,为了进一步缩小鸭肠炎病毒gC和gE的优势抗原表位区的氨基酸数,进行了第四轮的筛选,Western blot结果显示,鸭肠炎病毒gC的优势抗原表位区位于N端的73-88aa处;gE的优势抗原表位区位于303-313aa、317-326aa和461-481aa处。在确定鸭肠炎病毒gC和gE的优势抗原表位区的基础上,利用DNAMAN序列分析软件将DEV gC和gE的抗原表位区与其他公布的DEV序列进行比对,结果显示:筛选出的优势抗原表位区高度保守,这为进一步了解DEV抗原结构奠定了基础。

全文目录

摘要  10-11
英文摘要  11-13
1 引言  13-26
  1.1 鸭病毒性肠炎概述  13-20
    1.1.1 DEV 概述  13-15
    1.1.2 鸭病毒性肠炎流行病学  15-16
    1.1.3 诊断  16-19
    1.1.4 鸭病毒性肠炎的防制  19-20
  1.2 疱疹病毒糖蛋白 C（gC）的研究进展  20-23
    1.2.1 疱疹病毒糖蛋白 C 的特点  20-21
    1.2.2 疱疹病毒糖蛋白 C 的生物学功能  21-22
    1.2.3 疱疹病毒糖蛋白 C 的应用  22-23
  1.3 疱疹病毒糖蛋白 E（gE）的研究进展  23-25
    1.3.1 疱疹病毒糖蛋白 E 的特点  23
    1.3.2 疱疹病毒糖蛋白 E 的生物学功能  23-24
    1.3.3 疱疹病毒糖蛋白 E 的应用  24-25
  1.4 研究的目的与意义  25-26
2 材料与方法  26-42
  2.1 实验材料  26-27
    2.1.1 质粒、载体、菌种  26
    2.1.2 试剂  26
    2.1.3 血清及酶标抗体  26
    2.1.4 主要试验器材及仪器设备  26-27
  2.2 实验方法  27-42
    2.2.1 DEV-gC 抗原表位的初步筛选  27-31
    2.2.2 DEV-gC 抗原表位的第二轮筛选  31-32
    2.2.3 DEV-gC 抗原表位的第三轮筛选  32-34
    2.2.4 DEV-gC 抗原表位的第四轮筛选  34-35
    2.2.5 DEV-gE 抗原表位的初步筛选  35-37
    2.2.6 DEV-gE 抗原表位的第二轮筛选  37-39
    2.2.7 DEV-gE 抗原表位的第三轮筛选  39-40
    2.2.8 DEV-gE 抗原表位的第四轮筛选  40-42
3 结果与分析  42-62
  3.1 DEV-gC 抗原表位的初步筛选  42-44
    3.1.1 DEV-gC-1~7 基因的 PCR 扩增结果  42
    3.1.2 原核表达载体pET-32a-DEV-gC-1~7 的构建  42-43
    3.1.3 DEV-gC-1~7 基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化  43
    3.1.4 DEV-gC-1~7 基因表达蛋白的抗原性分析  43-44
  3.2 DEV-gC 抗原表位的第二轮筛选  44-46
    3.2.1 DEV-gC-1.1~2.3 基因的PCR 扩增结果  44-45
    3.2.2 原核表达载体pET-32a-DEV-gC-1.1~2.3 的构建  45
    3.2.3 DEV-gC-1.1~2.3 基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化  45-46
    3.2.4 DEV-gC-1.1~2.3 基因表达蛋白的抗原性分析  46
  3.3 DEV-gC 抗原表位的第三轮筛选  46-48
    3.3.1 原核表达载体pET-32a-gC-2.1-A~E 的构建  46-47
    3.3.2 DEV-gC-2.1-A~E 基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化  47
    3.3.3 DEV-gC-2.1-A~E 基因表达蛋白的抗原性分析  47-48
  3.4 DEV-gC 抗原表位的第四轮筛选  48-50
    3.4.1 原核表达载体pET-32a-gC-2.1-B-1~C-2 的构建  48
    3.4.2 DEV-gC-2.1-B-1~C-2 基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化  48-49
    3.4.3 DEV-gC-2.1-B-1~C-2 基因表达蛋白的抗原性分析  49
    3.4.4 DEV-gC 优势抗原表位的分析  49-50
  3.5 DEV-gE 抗原表位的初步筛选  50-53
    3.5.1 DEV-gE-1~7 基因的PCR 扩增结果  50-51
    3.5.2 原核表达载体pET-32a-DEV-gE-1~7 的构建  51
    3.5.3 DEV-gE-1~7 基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化  51-52
    3.5.4 DEV-gE-1~7 基因表达蛋白的 Western blot 分析  52-53
  3.6 DEV-gE 抗原表位的第二轮筛选  53-55
    3.6.1 DEV-gE-5.1~5.3 和7.1~7.4 基因的PCR 扩增结果  53
    3.6.2 原核表达载体pET-32a-DEV-gE-5.1~5.3 和7.1~7.4 的构建  53
    3.6.3 DEV-gE-5.1~5.3 和7.1~7.4 基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化  53-55
    3.6.4 DEV-gE-5.1~5.3 和7.1~7.4 基因表达蛋白的抗原性分析  55
  3.7 DEV-gE 抗原表位的第三轮筛选  55-57
    3.7.1 原核表达载体pET-32a-gE-5.3-A~E 和gE-7.3-A~7.4-C 的构建  55-56
    3.7.2 DEV-gE-5.3-A~E and gE-7.3-A~7.4-C 基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化  56
    3.7.3 DEV-gE-5.3-A~E 和gE-7.3-A~7.4-C 基因表达蛋白的抗原性分析  56-57
  3.8 DEV-gE 抗原表位的第四轮筛选  57-62
    3.8.1 原核表达载体pET-32a-gE-5.3-B-1~E-2 和gE-7.3-B-1~7.4-B-2 的构建  57-58
    3.8.2 DEV-gE-5.3-B-1~E-2 和gE-7.3-B-1~7.4-B-2 基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化  58-59
    3.8.3 DEV-gE-5.3-B-1~E-2 和 gE-7.3-B-1~7.4-B-2 基因表达蛋白的抗原性分析  59-60
    3.8.4 DEV-gE 优势抗原表位的分析  60-62
4 讨论  62-65
  4.1 选择鸭肠炎病毒gC 和gE 作为表位筛选的目的蛋白的依据  62
  4.2 短肽基因的克隆策略  62
  4.3 抗原表位作图方法的选择  62-64
  4.4 DEV-gC 和gE 优势抗原表位的筛选  64-65
5 结论  65-66
致谢  66-67
参考文献  67-75
攻读硕士学位期间发表的学术论文  75

鸭肠炎病毒gC和gE优势抗原表位的筛选

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