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胞外蛋白酶抑制剂基因expi对大鼠肝再生的作用研究

作　者: 张明
导　师: 徐存拴
学　校: 河南师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 大鼠肝再生胞外蛋白酶抑制剂(expi) RNA干扰尾静脉液压转基因
分类号: Q343
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

胞外蛋白酶抑制剂基因expi编码的蛋白与蛋白酶活性的有关,并参与细胞的迁移和凋亡活动。本实验室的大鼠再生肝Rat Genome 230 2.0芯片检测结果表明,expi在大鼠2/3肝切除后6h起始表达,6-72h持续表达上调,并在30h达到表达高峰,是对照的33倍。但目前还没有人研究其在肝再生中的功能,而作为重要生命活动的肝再生也涉及蛋白质降解,细胞迁移和凋亡等生理生化活动,了解该基因在肝再生中的功能,有助于揭示肝再生分子机制。为此,本文挑选出基因expi,以Higgins等建立的大鼠2/3肝切除模型做为研究对象,利用大鼠尾静脉液压转基因技术,通过基因添加和RNA干涉的方法,研究expi在大鼠肝再生中的作用。根据expi的基因序列设计引物并克隆该基因,同时设计其两条RNA干涉片段,然后进行载体的构建。将上述测序正确的基因及其干涉片段连接到不同的载体上,构建三套载体:一套是表达载体pEGFP-N1-expi,用于基因添加实验;另一套是干涉载体,包括pGenesil-1.0-E6和pGenesil-1.0-E147,用于干涉目的基因的实验;最后一套是检验载体,包括pGenesil-1.0-E6-expi,pGenesil-1.0-E147-expi和pGenesil-1.0-HK-expi,用于检验设计的两条干涉片段是否对靶基因产生干涉作用。将构建的三条检验载体分别进行尾静脉液压转基因操作,通过观察转干涉检验载体的绿色荧光蛋白阳性细胞率(转染率)相较对照检验载体是否有明显减少,来判断设计的干涉片段是否对靶位点具有干涉作用。将表达载体和干涉载体分别进行液压转基因操作,分别在转基因后6、12、24、36、48、60、72和84h取材观察其绿色荧光蛋白阳性细胞率、通过统计分析得出各载体在大鼠肝脏组织中表达高峰的时间点,结合expi芯片检测结果,得出2/3肝切除后的最佳转基因时间。根据以上结果,利用2/3肝切除手术制备的大鼠肝再生模型和液压转基因技术展开expi对大鼠肝再生过程影响的研究。将制备好的转基因后的再生肝材料分别于2/3肝切除后72、120和168h取出,用荧光显微技术、统计学方法和常规组织学技术对死亡率、表达动力学、肝指数和组织形态结构等方面结果进行观察与分析。测序和电泳检测结果显示:基因expi克隆成功,其表达载体、干涉载体和检验载体构建成功。荧光观察结果表明,转检验载体pGenesil-1.0-E6-expi和pGenesil-1.0-E147-expi的绿色荧光蛋白阳性细胞率明显低于其对照载体pGenesil-1.0-HK-expi,这说明设计的两干涉片段对靶位点均具有干涉作用。转表达载体pEGFP-N1-expi和干涉载体pGenesil- 1.0-E6与pGenesil-1.0-E147后,统计分析阳性细胞率得出各载体在大鼠肝脏组织中表达高峰的时间点是转基因后12h,结合expi芯片检测结果,得出最佳转基因时间点是2/3肝切除后18h。肝指数检测结果表明,在进行expi基因添加时,肝指数高于对照;进行expi基因干涉时,肝指数则低于对照。总之,本文成功克隆了expi基因,并成功构建了其表达载体、干涉载体和检验载体,根据上述体内检测结果初步推测expi对大鼠肝再生有一定的影响,这为肝再生分子机理研究提供了资料。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
缩略语表  10-11
第一章文献综述  11-25
  1 肝再生研究进展  11-18
    1.1 肝再生  11
    1.2 肝再生的动物模型  11-13
    1.3 肝再生的分子机制  13-18
  2 胞外蛋白酶抑制剂基因expi 研究进展  18-23
    2.1 expi 基因结构和功能  18-20
    2.2 expi 与肝再生  20-23
  3 本论文研究目的和意义  23-25
    3.1 研究目的  23
    3.2 研究意义  23
    3.3 研究方案  23-25
第二章 expi 对大鼠肝再生的作用研究  25-79
  1 引言  25-26
  2 实验材料与方法  26-49
    2.1 主要试剂与仪器  26-30
    2.2 实验动物  30
    2.3 大鼠2/3 肝切除（PH）模型制作  30-31
    2.4 expi 基因克隆  31-38
    2.5 expi 干涉片段制备  38-39
    2.6 表达载体PEGFP-N1-expi 的构建  39-41
    2.7 干涉载体PGenesil-1.0-E6 及PGenesil-1.0-E147 的构建  41-42
    2.8 检验载体PGenesil-1.0-E6-expi、-E147-expi 及-HK-expi 的构建  42-44
    2.9 质粒的大量提取和纯化  44-45
    2.10 大鼠肝脏的液压转基因  45-46
    2.11 转目的质粒后大鼠死亡率检测  46
    2.12 转目的质粒后肝组织的显微结构观察  46-48
    2.13 目的质粒在大鼠肝脏内的表达动力学  48
    2.14 转目的质粒后大鼠再生肝肝指数检测  48-49
  3 结果  49-73
    3.1 expi 基因克隆  49-51
    3.2 expi 的干涉片段制备结果  51-52
    3.3 表达载体pEGFP-N1-expi 的构建及结构  52-54
    3.4 干涉载体pGenesil-1.0-E6 及pGenesil-1.0-E147 构建及结构  54-56
    3.5 检验载体pGenesil-1.0-E6-expi、pGenesil-1.0-E147-expi 及pGenesil-1.0-HK-exp的构建及结构  56-58
    3.6 转目的质粒后后大鼠死亡率  58-59
    3.7 转目的质粒后肝组织的显微结构观察  59-64
    3.8 目的质粒在大鼠再生肝内的表达动力学  64-71
    3.9 转目的质粒后大鼠肝再生情况  71-73
  4 讨论  73-79
    4.1 表达载体的选择  73-74
    4.2 expi 基因克隆  74-75
    4.3 expi 基因相关载体构建  75-76
    4.4 大鼠肝脏液压转基因技术的优缺点  76
    4.5 expi 在大鼠肝再生中的作用及机理  76-79
总结与结论  79-81
参考文献  81-93
致谢  93-94
攻读学位期间参加的科研项目和发表的学术论文  94-95

胞外蛋白酶抑制剂基因expi对大鼠肝再生的作用研究

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