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人呼吸道合胞病毒F蛋白非复制型重组腺病毒的构建与鉴定

作　者: 袁媛
导　师: 何金生
学　校: 安徽医科大学
专　业: 免疫学
关键词: 人呼吸道合胞病毒真核表达融合糖蛋白非复制型重组腺病毒
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

目的：人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus，RSV)广泛分布于世界各地，是导致婴幼儿严重下呼吸道感染最重要的病毒病原。病毒感染机体后的免疫保护机制尚未明确，也无特异性防治方法。RSV融合糖蛋白(fusionglycoprotein，F)和吸附蛋白(attachment glycoprotein，G)是RSV仅有的两种中和抗原。RSV只有一种血清型，主要由于G蛋白抗原性的差异，可进一步分为A和B两利种抗原亚型。F蛋白在RSV不同亚型间具有高度的抗原同源性，是主要的交叉保护性抗原。本研究拟克隆RSV F基因，采用非复制型腺病毒载体，利用同源重组方法，构建含有F基因的非复制型腺病毒重组体，获得一株可表达RSV F的非复制型重组腺病毒FGAd／HRSVF，用于体内免疫效果及免疫保护作用的研究。方法：本文根据F基因碱基序列，设计并合成引物，以F基因逆转录产物cDNA为模板，采用高保真DNA聚合酶，PCR扩增，得到F基因编码序列。然后克隆到pGEM-3zf载体中，序列测定正确后，将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上，酶切鉴定，脂质体法转染COS-7细胞，应用Western blot方法分析F基因表达情况。将F基因亚克隆于腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV，Pme Ⅰ线性化重组穿梭载体，与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在E．coli BJ5183细胞内同源重组得到重组腺病毒DNA质粒。以Pac Ⅰ酶切获得的重组腺病毒DNA分子，脂质体法转染293细胞，产生基因组结构均一的重组腺病毒。Western blot鉴定目的基因表达。结果：采用RT-PCR法扩增获得F蛋白基因编码序列。核酸序列分析显示没有发生无义突变。转染COS-7细胞后，利用Western blot方法检测到了F蛋白的特异性条带。进一步克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle CMV，在Ecoli BJ5183内和腺病毒骨架载体pAdeasy-1实现同源重组，获得克隆有RSV F的重组腺病毒质粒pFGAd／HRSVF，经Pac Ⅰ线性化产生重组腺病毒DNA分子，转染293细胞。观

全文目录

中英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
实验设计与流程  11-12
前言  12-14
实验材料与方法  14-33
结果  33-45
讨论  45-48
结论  48-49
参考文献  49-53
附录  53-54
致谢  54-55
综述  55-62

人呼吸道合胞病毒F蛋白非复制型重组腺病毒的构建与鉴定

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